用于同时检测大范围蛋白质浓度的方法和装置与流程

用于同时检测大范围蛋白质浓度的方法和装置
1.本技术是申请日为2017年11月29日，申请号为201780073354.0，发明名称为“用于同时检测大范围蛋白质浓度的方法和装置”的申请的分案申请。
2.对相关申请的交叉引用
3.本技术要求于2016年11月29日提交的美国临时申请no.62/427,624的优先权，其公开内容通过引用整体并入本文。


背景技术：

4.许多已知的技术和仪器适用于色谱地和电泳地分离蛋白质。例如，标题均为“methods and devices for analyte detection”的美国专利no.9,304,133和no.9,400,277描述了经由毛细管电泳分离蛋白质，每个专利的公开内容通过引用整体并入本文。
5.在一些情况下，可以需要或期望在一个或多个位置确定分析物的量和/或浓度。存在一些已知的方法来使用增强化学发光(ecl)技术测量分析物的量和/或浓度。例如，可以使用具有辣根过氧化物酶(hrp)的抗体来测量毛细管内壁上捕获的蛋白质的量，该酶与毛细管中的鲁米诺(luminal)反应以产生化学发光信号，该信号可以以光子/秒和/或检测次数/秒为单位进行测量。
6.传统的ecl技术包括用鲁米诺加载毛细管并当hrp
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缀合的蛋白质与鲁米诺反应时捕获毛细管的一个或多个图像。传统的ecl技术可以适用于每个峰含有相似量的蛋白质和/或分离产生单个峰的情况。但是，传统的ecl技术具有差的动态范围。换句话说，传统的ecl技术不适用于分离产生多个峰以及至少两个峰含有显著不同量的蛋白质的情况。在这种情况下，具有较高蛋白质浓度的峰将使检测器饱和和/或盲目，具有较高浓度的峰将消耗掉所有可用的鲁米诺，和/或具有较低浓度的蛋白质的峰将无法检测到，这些当中的任何一个都将降低可以确定蛋白质的量和/或浓度的准确度。因此需要用于同时检测大范围蛋白质量和/或浓度的方法和装置。
附图说明
7.图1是根据实施例的、可操作以测量大范围的分析物量和/或浓度的仪器的示意图。
8.图2是根据实施例的、用于测量分析物群的浓度和/或量的方法的流程图。
9.图3是随时间检测到的、由ecl技术产生的光的模拟的图。
10.图4和5描绘了用于测量分析物的浓度和/或量的已知技术与根据本文描述的方法测量分析物的浓度和/或量的方法的比较。
11.图6是根据实施例的、基于鲁米诺消耗和传质系数的测量误差的模拟的图。
具体实施方式
12.使用ecl技术量化多种技术中包含的蛋白质的特定问题是选择适当的曝光时间来对毛细管成像。曝光时间太短，那么具有低量和/或浓度的蛋白质的峰可能无法检测到和/
或可能无法准确量化。曝光时间太长，那么具有高量和/或浓度的蛋白质的峰可能使检测器饱和和/或盲目、洗掉附近的峰，和/或消耗掉所有可用的鲁米诺。一种可用的折衷解决方案是顺序地进行多次相对短的曝光。然后可以相对于时间绘制每个峰的强度，并且可以使用信号相对于时间的预期变化的数学模型外推初始强度(例如，以光子/秒为单位测量)。可以基于初始强度确定峰值处蛋白质的浓度和/或量。但是，这种技术会对小蛋白质浓度产生显著的统计误差并对大蛋白质浓度产生系统误差。
13.本文描述的一些实施例涉及一种方法，该方法包括经由毛细管中的电泳来分离含分析物的样本。毛细管加载有化学发光剂，诸如鲁米诺，其被配置为与分析物(例如，hrp
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缀合的蛋白质)反应以产生指示沿着毛细管长度的每个位置处的分析物的浓度和/或量的信号。在第一时间段内捕获含有分析物和化学发光剂的毛细管的第一图像。在第二时间段内捕获含有分析物和化学发光剂的毛细管的第二图像。第二时间段比第一时间段长。换句话说，毛细管的第二图像具有比毛细管的第一图像更长的曝光时间。使用第一图像确定第一位置处的第一分析物群的浓度和/或量，并且使用第二图像确定第二位置处的第二分析物群的浓度和/或量。在一些实施例中，该方法可以与代替化学发光剂的生色检测剂一起使用。
14.本文描述的一些实施例涉及一种方法，该方法包括经由毛细管电泳来分离含有第一分析物群和第二分析物群的样本。分离样本可以导致第一分析物群沿着毛细管的长度迁移到第一位置，并且第二分析物群沿着毛细管的长度迁移到第二位置。捕获具有不同曝光时间的毛细管的图像。可以选择第一图像，其中指示第一分析物群的浓度和/或数量的第一光信号的强度超过预定阈值。可以通过将在第一图像中检测到的第一光信号的强度除以第一图像的曝光时间来确定第一光信号的初始强度。第一光信号的初始强度可以用于计算第一分析物群的浓度和/或量。可以选择第二图像，其中第二光信号的强度超过预定阈值(例如，相同的预定阈值)。可以通过将在第二图像中检测到的第二光信号的强度除以第二图像的曝光时间来确定第二光信号的初始强度。第二光信号的初始强度可以用于计算第二分析物群的浓度和/或量。
15.本文描述的一些实施例涉及一种装置，该装置被配置为实现部署在毛细管中的多个分析物群(例如，蛋白质)的电泳分离。检测器被配置为沿着毛细管的长度捕获多个位置的图像。换句话说，检测器可以可操作以执行毛细管的全列成像。计算实体(例如，处理器和/或存储器)被配置为基于沿着毛细管长度的第一位置处的第一信号的强度超过预定阈值来选择由检测器捕获的第一图像。第一信号的强度指示位于第一位置的第一分析物群的浓度和/或量。可以例如基于第一信号的强度来计算第一分析物群的浓度和/或量。可以基于沿着毛细管长度的第二位置处的第二信号的强度超过预定阈值(例如，相同的预定阈值)来选择由检测器捕获的第二图像。第二图像可以具有与第一图像的曝光时间不同的曝光时间。第二信号的强度指示位于第二位置的第二分析物群的浓度和/或量。可以例如基于第二信号的强度和第二曝光时间来计算第二分析物群的浓度和/或量。
16.图1是根据实施例的、用于测量分析物(例如，蛋白质)的浓度和/或量的仪器的示意图。仪器包括毛细管110、电极115和检测器120。毛细管110可以桥接两个储存器140。每个储存器可以是例如阳极电解质储存器、阴极电解质储存器和/或样本储存器。
17.仪器可以被配置为将含有分析物的样本吸入毛细管110或以其它方式接受含有样
本的毛细管110。可以经由电极115在毛细管110上施加电势，这可以实现样本的电泳分离。换句话说，由于由电极115施加电势，分析物群可以沿着毛细管110迁移到不同的位置。具有相似特性(例如，迁移率、等电点等)的分析物群可以在毛细管110中形成峰或带。
18.如本文进一步详细讨论的，仪器可以确定每个峰中的分析物的浓度和/或量。在一些情况下，毛细管110的第一位置处的第一峰152可以包括比毛细管110的第二位置处的第二峰154明显更高的分析物量和/或浓度。换句话说，第一峰值152可以包括比第二峰值154多3倍、5倍、10倍、50倍、100倍或更多的分析物。
19.检测器120(例如，相机、电荷耦合器件(ccd)、互补金属氧化物半导体(cmos)检测器等)被配置为捕获毛细管110、毛细管内的分析物110和/或由毛细管110内的ecl反应发射的光子的图像。检测器120可以是全列检测器。换句话说，检测器120可以可操作以捕获毛细管110的整个长度、毛细管110的长度的实质部分(例如，至少80％)、毛细管110的整个分离区域，和/或捕获包含沿着毛细管长度分开的至少两个不同位置(例如，与第一峰152和第二峰154相关联的位置)的图像。
20.处理器162和存储器164通信耦合到检测器120。处理器162和存储器164可以被统称为计算实体。处理器162可以是例如通用处理器、现场可编程门阵列(fpga)、专用集成电路(asic)、数字信号处理器(dsp)等。处理器162可以被配置为从存储器(例如，存储器164)检索数据和/或将数据写入存储器，存储器164可以是例如随机存取存储器(ram)、存储器缓冲器、硬盘驱动器、数据库、可擦除可编程只读存储器(eprom)、电可擦除可编程只读存储器(eeprom)、只读存储器(rom)、闪存、硬盘、软盘、云存储装置等。处理器162和存储器164被配置为选择检测器120的曝光时间、从检测器120接收图像、选择从检测器120接收的图像用于分析、和/或计算分析物群的浓度和/或量，如本文进一步详细描述的。
21.在本文所述的一些实施例中，在毛细管被成像之前和/或在捕获毛细管的每个图像之前，将化学发光剂(例如，鲁米诺)注射到毛细管中。换句话说，该仪器可以包括鲁米诺注射器115。处理器162可以可操作以使鲁米诺(或任何其它合适的化学发光剂)从鲁米诺注射器115流出并通过毛细管。毛细管110可以含有hrp，其可以涂覆到毛细管110的壁上。可以将分析物(或分析物群)配置为链接至hrp以形成hrp
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缀合的分析物。在注射鲁米诺之后，鲁米诺扩散到毛细管的壁并与hrp
‑
缀合的分析物反应，释放光子，这可以被检测器120检测到。通过鲁米诺和hrp的这种增强化学发光(ecl)反应释放的光子指示分析物群。
22.毛细管的典型内径(id)为100μm，典型长度为5cm，因此在检测器120进行测量(例如，曝光)的时间内，鲁米诺仅沿着毛细管的长度扩散一小部分，但是具有许多与毛细管壁的碰撞。因此，局部信号指示hrp
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缀合的分析物的局部存在，但不依赖于其它信号或沿着毛细管长度超过约1mm远存在的其它分析物。换句话说，在峰152距离峰154大于约1mm的情况下，从峰152发射的光的强度独立于从峰154发射的光的强度。
23.ecl反应的初始光强度(光子/秒)与毛细管内特定位置(例如，峰)处的蛋白质(例如，分析物)的量成比例。因而，如果可以确定初始光强度，那么可以确定蛋白质浓度和/或量。但是，许多挑战在准确确定初始光强度方面存在困难。因为鲁米诺被化学发光反应消耗，所以，在少量鲁米诺可用的情况下，诸如在基于毛细管的技术中，初始光强度常常通过多次测量光强度确定，以及通过分析衰减曲线确定初始光强度。检测器可以用于进行多次曝光，并拟合强度相对于时间的曲线并外推回至初始时间。对于低浓度的蛋白质，期望进行
相对长时间的曝光，因为总强度较低并且化学发光的衰减较慢。但是，对于高浓度的蛋白质，期望进行短时间曝光，因为总强度较高并且化学发光的衰减较快。但是，在许多情况下，毛细管可以在一个区域中含有高浓度的蛋白质，而在另一个可能附近的区域中含有低浓度的蛋白质。在这种情况下，如果进行长时间曝光，那么高浓度的区域可以在曝光过程中“烧尽”消耗掉全部或大部分可用的鲁米诺，从而导致错误的低浓度读数和/或掩蔽附近的低浓度信号。相反，对于低蛋白质浓度，短时间曝光易受显著统计误差的影响。因此，需要用于准确确定具有高动态范围的蛋白质量的系统和方法。换句话说，需要准确表征含有具有高浓度蛋白质和低浓度蛋白质的区域的列(例如，毛细管)。上面参考图1描述的仪器可以可操作以执行对于高动态范围准确确定量和/或浓度的方法。
24.图2是根据实施例的、用于确定分析物的量和/或浓度的方法的流程图。图2的方法可以由上面参考图1描述的仪器来执行。该方法包括在210处分离样本，在215处对样本加载鲁米诺，以及在220处捕获毛细管的图像。
25.在一些实施例中，在215处鲁米诺可以多次加载到毛细管中。在220处，每次毛细管加载鲁米诺时，可以捕获至少一次曝光。曝光长度可以变化。例如，每次毛细管加载鲁米诺时，曝光持续时间可以加倍，诸如从1秒到2秒到4秒，等等直到256秒或任何其它合适的最大曝光持续时间。任何合适的暴露持续时间的进展都是可能的。例如，每次曝光可以具有前一曝光持续时间的任何整数倍(或任何其它倍数)的持续时间。
26.改变暴露时间可以产生至少一次适合于具有良好信噪比且具有非常少量信号衰减(即，积分信号相对于曝光持续时间仍然是线性的)的蛋白质浓度的曝光。换句话说，高曝光持续时间可以特别适合表征低蛋白质浓度，而低曝光持续时间可以适合于表征高蛋白质浓度。在一些情况下，硬件和/或运行时间约束可以限制曝光持续时间的界限。例如，极低浓度可以受到最大曝光持续时间的限制，而极高浓度可以受到最小曝光持续时间的限制。
27.因此，在230处，可以选择用于确定第一分析物群的浓度和/或量的第一图像。第一分析物群可以沿着毛细管部署在第一位置。在一些实施例中，一旦检测到指示第一蛋白质群的信号，检测器就可以继续捕获数据(例如，光子)直到超过预定阈值(例如，25000次计数)。在这种实施例中，曝光时间由达到预定阈值所需的时间确定。在其它实施例中，可以预先确定一系列曝光持续时间(例如，1秒、2秒、4秒、8秒等)，如上面所讨论的。无论如何确定曝光持续时间，都可以通过识别具有最短曝光持续时间的图像来选择用于确定第一分析物群的量的第一图像，其中第一位置处的信号超过预定强度阈值。如上面所讨论的，增强化学发光反应的初始强度指示该位置处的分析物的量和/或浓度。因此，在235处，可以通过将在第一图像中检测到的信号的强度(光子或计数)除以曝光持续时间(秒)来确定第一分析物群的量。
28.可以对于沿着毛细管的具有峰的每个位置重复选择用于确定分析物群的浓度和/或量的图像。例如，第二分析物群可以部署在第二位置处。通过识别第二位置的信号超过预定强度阈值的图像，可以在240处选择第二图像。在第二图像中检测到的信号可以除以第二图像的曝光持续时间，并且可以在245处确定第二分析物群的量。
29.可以以这种方式针对每个峰或带选择图像，并且可以以类似的方式确定每个峰内的分析物的浓度和/或量。选择其中与特定峰值相关联的信号超过预定阈值的图像可以减轻选择已知ecl技术所经受的适当曝光时间所固有的折衷。例如，可以使用非常短的曝光时
间(例如，1秒)来确定具有最高初始强度(并因此具有最高浓度和/或量)的峰的量。这种短时间曝光可能太短以至于无法确定毛细管中其它峰的量。换句话说，其它峰可以对于短曝光时间处于或低于图像的检测阈值和/或可以具有低信噪比。作为另一个示例，可以使用相对长的曝光时间(例如，64秒)来确定具有低初始强度(并因此具有低浓度和/或量)的峰的量。这种长时间曝光可能不适合于确定具有较高浓度和/或量的分析物的其它峰的浓度和/或量。例如，在64秒的测量(曝光)下，高强度峰可以消耗掉所有局部可用的鲁米诺和/或高强度衰减的显著非线性性可以引入相对大的测量误差。
30.在一些情况下，可以通过选择至少一个峰高于预定计数阈值的最短曝光来选择最短标称曝光持续时间。预定计数阈值可以与初始鲁米诺浓度相关，初始鲁米诺浓度可以在整个毛细管中均匀并且与任何具体的亚群浓度无关。在这个预定计数阈值处，超过预定阈值的信号通常将具有合适的信噪比而没有显著的信号衰减。
31.如上面所讨论的，可以捕获毛细管的多个图像，并且图像可以具有不同的持续时间。在一些情况下，可以采取一系列曝光，其中每次曝光具有相同或近似相同的曝光持续时间。第一系列曝光可以具有例如最短的标称曝光持续时间。例如，来自第一系列曝光的每次曝光可以具有1秒的曝光持续时间。第二系列曝光可以各自具有例如2秒的曝光持续时间，等等。在一些情况下，来自一系列曝光的每次曝光的曝光持续时间可以与标称曝光持续时间不同。例如，在第二系列曝光具有2秒的标称曝光持续时间的情况下，可以捕获曝光持续时间为1.6秒、1.8秒、2.0秒、2.4秒等的曝光。换句话说，来自一系列曝光的曝光的曝光持续时间可以对于那个系列围绕标称曝光持续时间加权。以这种方式，可以平滑从一个标称曝光持续时间到另一个标称曝光持续时间的过渡。如本文进一步详细描述的，可以通过将积分信号(检测到的光子和/或计数)除以实际曝光持续时间来确定光强度。
32.本文描述的一些实施例采用如下所示的圆形毛细管中的鲁米诺扩散和反应的数学模型，其对于具有半径(b)的毛细管将鲁米诺浓度作为时间(t)和毛细管内的径向位置(r)以及反应速率与扩散率的不同比率(传质biot数，bi)的函数来进行预测。该模型显示，如果在消耗约15％的鲁米诺时(即，最大积分信号的15％处)测量积分信号，那么近似初始反应速率(与目标蛋白质浓度成比例)的误差对于bi<0.5在窄范围内(15
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25％)。对于bi<0.1，误差等于％消耗的鲁米诺(反应受限过程)。只有目标浓度的比例是有意义的(单位是任意的)，因此任何固定的误差百分比都会在这种比率中被抵消。
[0033][0034]
本文进一步详细讨论的上述模型和图6证明，通过为每个分析物群(例如，沿着毛细管的每个位置)选择其中信号超过预定阈值的图像，对于那个信号在曝光期间的衰减可以近似为线性。因此，可以通过将那个图像的强度除以曝光持续时间来计算初始强度。
[0035]
曝光期间的实际衰减是指数级的。因此，预定阈值越高，线性化近似变得越不准确。但是，预定阈值越低，信噪比越低。因此，选择适当的预定阈值是线性性与噪声之间的平衡。下面示出的表1给出了用于选择适当的预定阈值的实验数据。实验数据揭示，选择信号强度的预定阈值约为传感器饱和级别的25％导致线性斜率与实际衰减的比率低于0.89，这是合适的折衷。其它合适的阈值可以在传感器的饱和级别的30％到传感器的饱和级别的20％之间。
[0036]
表1
[0037]
时间/lambda速率比率斜率0.0250.024690087970.98760351890.050.04877057550.975411510.0750.072256513670.96342018230.10.095162581960.95162581960.150.13929202360.92861349050.20.18126924690.90634623460.250.22119921690.88479686770.30.25918177930.86393926440.350.29531191030.84374831510.40.3296799540.82419988490.50.39346934030.7869386806
[0038]
为了最小化线性化误差的空间变化(以及在强度曲线中产生的不连续跳跃)，可以采用附加的插值步骤。可以使用在具有离散曝光时间的多个图像中捕获的信号。在选择信号最接近预定阈值的图像(或具有信号超过预定阈值的最短曝光时间的图像)之后，附加图像(诸如紧接在前和/或后续图像(例如，具有下一个更长和/或下一个更短的曝光持续时间的图像))被分析并用于内插到将产生目标阈值的预测曝光时间。换句话说，可以计算达到
预定阈值的预测曝光时间。预测曝光时间可以不与任何实际捕获的图像的曝光时间对应。在这种实施例中，可以通过将预定阈值除以预测曝光时间来执行计算初始强度。在一些实施例中，可以通过在刚好低于预定阈值的测量和刚好高于预定阈值的测量之间线性内插来计算预测曝光时间。
[0039]
示例1
[0040]
图3描绘了使用本文所述的技术的模拟信号级别。图3描绘了三个强度级别，“低”、“中等”和“高”。中等强度级别的强度是低强度级别强度的四倍，而高强度级别的强度是中等强度级别的强度的四倍。预定计数阈值可以是25000，其可以例如基于如上面所讨论的检测器灵敏度和/或饱和度来确定。换句话说，计数阈值25000可以是传感器的饱和级别的25％。可以为低强度信号选择16sec的标称曝光持续时间，可以为中等强度信号选择4sec的标称曝光持续时间，并且可以为高强度信号选择1sec的标称曝光持续时间。通过将积分信号除以曝光持续时间来确定强度(光子/秒)。
[0041]
表2
[0042]
信号输入曝光<25,000测得的信号强度高1sec22,00022.000/1＝22,000中等4sec22,00022.000/4＝5,500低16sec22,00022.000/16＝1,375
[0043]
示例2
[0044]
与已知技术相比，本文描述的技术可以增加蛋白质浓度分析的动态范围。例如，图4和5图示了标记为“多图像”的确定蛋白质浓度的已知方法，其描绘了当处理大范围的蛋白质浓度时发生的“烧尽”现象。由于在适合于准确地解析低蛋白质浓度的测量(曝光)期间高浓度的蛋白质消耗化学发光反应中可用的鲁米诺，烧尽发生。换句话说，解析低蛋白质浓度所需的曝光持续时间太长以至于不能对于高蛋白质浓度检测化学发光的衰减。
[0045]
图4和5还图示了使用本文描所述的技术的“hdr”(高动态范围)分析。hdr分析图示了在没有原始多图像技术所示的高信号的大系统低估的情况下可以检测到高浓度(636μg/ml)和低浓度(63.6pg/ml)的蛋白质。
[0046]
如上所述，烧尽会不利地影响用于确定蛋白质浓度的已知技术。但是，本文描述的技术可以从烧尽中受益。例如，因为鲁米诺在毛细管内非常缓慢地扩散，当曝光持续时间从短到长增加时，短持续时间可以用于准确地量化具有高浓度蛋白质的区域。随着曝光持续时间的增加，具有高蛋白质浓度的区域可能已经耗尽了可用的鲁米诺。因此，具有较低强度的附近低浓度信号(否则将被与高浓度相关联的较亮信号掩蔽(例如，传感器致盲))可以在高浓度消耗了局部可用的鲁米诺之后捕获的较长持续时间曝光期间可解析和/或更准确地检测到。在高浓度峰相对接近低浓度峰的情况下，因此可以期望捕获多个图像而不更新鲁米诺。
[0047]
虽然上面已经描述了各种实施例，但是应当理解的是，它们仅以示例的方式呈现，而不是限制。在上述方法指示某些事件以一定次序发生的情况下，可以修改某些事件的排序。此外，某些事件可以在可能的情况下在并行处理中并发地执行，以及如上所述顺序执行。
[0048]
虽然已经特定地示出和描述了实施例，但是应当理解的是，可以在形式和细节上
进行各种改变。虽然已经将各种实施例描述为具有特定特征和/或部件的组合，但是其它实施例也有可能具有来自如上面所讨论的任何实施例的任何特征和/或部件的组合。例如，在一些实施例中，可以在一系列曝光之间更新鲁米诺，例如，通过使鲁米诺在曝光之间流入毛细管和/或通过连续地将鲁米诺流入毛细管。在一些情况下，可以在进行曝光时防止毛细管内的流动，例如，通过平衡毛细管两端的静水压力、通过消除成像期间的电泳处理，等等。