分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法与凝血酶检测方法与流程

技术特征：
1.一种分子印迹智能凝胶光栅，其特征在于，该凝胶光栅由基底和基底上的相互平行的凝胶条组成，凝胶条之间的间隙为凝胶光栅的狭缝，所述凝胶条由凝血酶响应型分子印迹凝胶构成；所述凝血酶响应型分子印迹凝胶是由含凝血酶印迹复合物的凝胶在洗脱掉凝胶网络中的凝血酶后形成的；所述凝血酶印迹复合物是由凝血酶特异性核酸适配体a1、凝血酶特异性核酸适配体a2与凝血酶的不同位点结合形成的，凝血酶特异性核酸适配体a1的核苷酸序列为5'
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/5acryd/ggt tgg tgt ggt tgg
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3'，凝血酶特异性核酸适配体a2的核苷酸序列为5'
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/5acryd/aga ccg tgg tag ggc agg ttg ggg tga ct
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3'；所述含凝血酶印迹复合物的凝胶是由n
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异丙基丙烯酰胺、凝血酶印迹复合物与交联剂交联反应形成的，在交联反应过程中，n
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异丙基丙烯酰胺的碳碳双键、凝血酶印迹复合物中的凝血酶特异性核酸适配体a1的5'端以及凝血酶特异性核酸适配体a2的5'端上的碳碳双键与交联剂上的碳碳双键发生加成反应形成凝胶网络；交联反应过程中，控制n
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异丙基丙烯酰胺与交联剂的摩尔比为1:(0.01～0.05)，凝血酶印迹复合物与交联剂的摩尔比为1:(1000～5000)。2.根据权利要求1所述分子印迹智能凝胶光栅，其特征在于，所述交联剂为四臂
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聚乙二醇丙烯酰胺、八臂
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聚乙二醇丙烯酰胺或二臂
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聚乙二醇丙烯酰胺。3.根据权利要求1所述分子印迹智能凝胶光栅，其特征在于，该凝胶光栅的周期与光栅高度之比为1:(0.01～0.1)。4.根据权利要求1所述分子印迹智能凝胶光栅，其特征在于，所述基底为硅烷化处理的石英玻璃片，凝胶条通过共价键与基底结合。5.权利要求1至4中任一权利要求所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)配制凝胶预聚液将凝血酶特异性核酸适配体a2加入凝血酶溶液中，搅拌20～40min，然后加入凝血酶特异性核酸适配体a1，搅拌20～40min，得到含凝血酶印迹复合物的溶液；凝血酶特异性核酸适配体a1以及凝血酶特异性核酸适配体a2与凝血酶的摩尔比均为1:(0.02～1)；向含凝血酶印迹复合物的溶液中加入n
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异丙基丙烯酰胺、交联剂、引发剂以及加速剂，在冰浴条件下充分震荡溶解，得到凝胶预聚液；凝胶预聚液中，n
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异丙基丙烯酰胺的浓度0.5～2.5mol/l，n
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异丙基丙烯酰胺与交联剂的摩尔比为1:(0.01～0.05)，n
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异丙基丙烯酰胺与引发剂的摩尔比为1:(0.005～0.05)，n
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异丙基丙烯酰胺与加速剂的摩尔比为1:(0.02～0.2)，凝血酶印迹复合物与交联剂的摩尔比为1:(1000～5000)；(2)制备含凝血酶的凝胶光栅将凝胶预聚液滴加到基底上，将凝胶光栅模板压在凝胶预聚液上，在4～10℃的条件下反应4～12h，剥离凝胶光栅模板，得到含凝血酶的凝胶光栅；(3)洗涤去除凝胶网络中的凝血酶将含凝血酶的凝胶光栅置于pbs缓冲液中浸泡洗涤，以去除未完全聚合的反应物，然后取出置于盐酸胍与氯化钠的混合溶液中充分浸泡以去除含凝血酶的凝胶光栅的凝胶网络结构中的凝血酶，在盐酸胍与氯化钠的混合溶液中浸泡的过程中，每隔6～12h更换一次盐酸胍与氯化钠的混合溶液，浸泡完成后，取出置于pbs缓冲液中充分浸泡洗涤，即得分子印
迹智能凝胶光栅。6.根据权利要求5所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述盐酸胍与氯化钠的混合溶液中，盐酸胍的浓度为3～6mol/l、氯化钠的浓度为1～2mol/l。7.根据权利要求5所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述pbs缓冲液的ph值为7.4、浓度为1～3mmol/l。8.根据权利要求5至7中任一权利要求所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述基底为硅烷化处理的石英玻璃片。9.根据权利要求8所述分子印迹智能凝胶光栅的制备方法，其特征在于，石英玻璃片的硅烷化处理方法如下：将洗净的石英玻璃片浸没于含硅烷偶联剂的醋酸
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醋酸钠缓冲液中保持10～30min，然后在50～60℃的烘箱中保持10～20min，用去离子水洗涤，干燥，即完成石英玻璃片的硅烷化处理；所述含硅烷偶联剂的醋酸
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醋酸钠缓冲液中，硅烷偶联剂的体积百分浓度0.5％～2％，所述醋酸
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醋酸钠缓冲液的ph值为4.5～5.5、浓度为0.05～0.2mol/l。10.一种基于分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法，其特征在于，该方法使用包括权利要求1至4中任一权利要求所述分子印迹智能凝胶光栅的光学检测装置进行检测，步骤如下：(1)确定凝血酶浓度的换算关系式
①
将空白试样加入光学检测装置的石英样品池中浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度i1和零级衍射光强度i0，计算空白试样的衍射效率；
②
按照标样中凝血酶浓度由低到高的顺序依次用凝血酶浓度已知的标样替换步骤
①
的空白试样，分别测定各标样对应的衍射效率，得到一系列标样对应的衍射效率；
③
计算各标样对应的衍射效率相对于空白试样的衍射效率的变化率，记作相对衍射效率，得到一系列相对衍射效率，以相对衍射效率为横坐标、以凝血酶浓度为纵坐标绘制工作曲线，确定凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系式；(2)测量待测试样中的凝血酶浓度
①
采用与步骤(1)相同的凝胶光栅替换原凝胶光栅，向光学检测装置的石英样品池中加入空白试样浸没凝胶光栅，待凝胶光栅的衍射光强度稳定后，读取空白试样的一级衍射光强度i1和零级衍射光强度i0，计算空白试样的衍射效率；
②
采用凝血酶浓度未知的待测试样替换步骤(2)
①
中的空白试样，测定待测试样的衍射效率；
③
计算待测试样的衍射效率相对于步骤(2)
①
中空白试样的衍射效率的相对衍射效率，根据凝血酶浓度与相对衍射效率的换算关系，计算待测试样中凝血酶的浓度；控制步骤(1)与步骤(2)的测试温度相同并且在20～35℃范围内的恒定温度。

技术总结
本发明提供了一种分子印迹智能凝胶光栅及其制备方法，所述该凝胶光栅由基底和基底上的相互平行的凝胶条组成，凝胶条之间的间隙为凝胶光栅的狭缝，所述凝胶条由凝血酶响应型分子印迹凝胶构成；所述凝血酶响应型分子印迹凝胶是由含凝血酶印迹复合物的凝胶在洗脱掉凝胶网络中的凝血酶后形成的。本发明还提供了基于分子印迹智能凝胶光栅的凝血酶检测方法。本发明可提高凝血酶检测的灵敏度和便捷性，所述凝血酶检测方法的检出限低至10


技术研发人员：褚良银 赵佳佳 汪伟 蔡泉威 谢锐 巨晓洁 刘壮
受保护的技术使用者：四川大学
技术研发日：2021.08.08
技术公布日：2021/11/4