一种藻类光合抑制法水体综合毒性表征参数构建方法与流程

1.本发明属于资源与环境领域，尤其是一种藻类光合抑制法水体综合毒性表征参数构建方法。


背景技术：

2.近年来随着人类活动的加剧，越来越多的污染物被直接或间接地排入环境水体，给水生生态系统造成很大冲击，水质毒性的快速检测对防治水体污染、保障水质安全具有重要意义。常规的水质毒性检测方法有理化分析方法、生物毒性检测方法等。其中生物毒性检测因综合多种有毒物质的相互作用，可直观反映污染水体对生物种群的综合毒性，被广泛使用。而其中基于藻类光合抑制效应的生物毒性检测方法因具有快速、便捷、可实现实时在线检测等特点，近年被广泛应用于水质毒性检测中。
3.基于藻类光合抑制效应的生物毒性检测方法是以体内叶绿素荧光为天然探针，通过测量藻类光合荧光参数的变化进而判定水中毒性物质的毒性效应，光合荧光参数实时反映藻类的光合代谢状态，可用于快速检测水体毒性。目前，已有研究多采用最大光化学量子产量fv/fm作为毒性检测的光合荧光参数。如juneau等考察了镰形纤维藻、羊角月牙藻、小球藻、微囊藻四种藻对hg
2
的胁迫反应，研究认为fv/fm是hg
2
毒性检测的合适指标；sbihi等人研究表明fv/fm可用于评估草甘膦的毒性。然而不同种类水体污染物对藻类光合抑制的作用位点与机理不同，导致与之响应的光合荧光参数也存在差异，单一光合荧光参数fv/fm对某些污染物无响应，导致可检测的污染物种类较少。另外，当前藻类光合抑制法检测水体综合毒性的表征参数fv/fm只能反应光合作用暗适应下psⅱ的光化学信息，检测灵敏度不高、检测毒性物质种类有限。


技术实现要素：

4.为了解决上述技术问题，针对水体污染物毒性检测研究中光合荧光参数较多、单一荧光参数fv/fm水体毒性检测灵敏度不高、可检测的污染物种类较少等问题，本发明提出了一种基于多参数融合的光合抑制效应表征参数pi
cte
的构建方法。该方法以快速叶绿素荧光ojip为研究对象，通过分析不同特征位点荧光对毒性物质的响应差异，融合j、i点荧光信息，并提出采用j、i点出现时间、曲线包围面积进行数据项加权，解决水体毒性检测中检测污染物种类较少、灵敏度不高的问题，为水体综合毒性的快速、准确测量提供有效手段。
5.本发明的技术方案为：一种藻类光合抑制法水体综合毒性表征参数构建方法，包括以下步骤：
6.步骤1：测定叶绿素荧光上升动力学曲线ojip，并获取f0、f
j
、f
i
、f
m
光合荧光参数；
7.步骤2：利用最大最小值归一化方法对f
j
、f
i
进行归一化处理得两个特征位点数据项f
j*
、f
i*
，提取曲线中j点与i点信息，并消除其受荧光测量绝对强度影响；
8.步骤3：利用定积分分别计算ojip曲线在[t
f0
,t
fj
]、[t
f0
,t
fi
]、[t
f0
,t
fp
]区间内与f＝f0构成封闭区域的包围的面积s
j
、s
i
、s
p
；
[0009]
步骤4：利用s
p
对s
j
、s
i
进行归一化处理得两个曲线段数据项s
j*
、s
i*
，提取o
‑
j和j
‑
i段曲线上升过程信息，并消除其受曲线测量绝对强度影响；
[0010]
步骤5：根据f
j*
、f
i*
、s
j*
、s
i*
计算结果以及t
f0
、t
fj
、t
fi
、t
fj
‑
t
f0
、t
fi
‑
t
f0
，利用公式(1)计算得到综合表征参数pi
cte
；
[0011][0012]
其中，f
j*
、f
i*
分别为归一化后ojip曲线中j、i点荧光强度，t
f0
、t
fj
、t
fi
、t
fp
分别为o、j、i、p点所对应的时间，s
j*
、s
i*
分别为归一化后o
‑
j、o
‑
i段曲线与f＝f0构成封闭区域的面积；
[0013]
步骤6：根据上述步骤1
‑
5分别计算实际水体实验组与空白对照组综合毒性参数pi’cte
和pi
cte
，计算出综合毒性参数变化率η，判断待测水体物质毒性强度。
[0014][0015]
有益效果：
[0016]
1、本发明利用毒性物质胁迫时，藻类光合作用的电子传递过程被阻断，从而导致ojip曲线中特征位点荧光强度和曲线上升过程变化这一生物原理，利用ojip曲线中j、i特征位点和o
‑
j、j
‑
i曲线上升过程与对毒性物质的响应差异，筛选能够有力表征环境毒物毒性的光合荧光参数f
j
、f
i
、s
j
、s
i
。
[0017]
2、本发明利用最大最小值归一化方法对f
j
、f
i
进行归一化处理得特征位点数据项f
j*
、f
i*
，将f
j
、f
i
取值范围同一缩放到[0,1]区间内，消除f
j
、f
i
受荧光测量绝对强度影响。
[0018]
3、本发明通过计算o
‑
j、o
‑
i段曲线包围面积在最大包围面积下的相对面积，利用s
p
对s
j
、s
i
进行归一化处理得两个曲线段数据项s
j*
、s
i*
，提取o
‑
j和j
‑
i曲线上升过程信息，并消除s
j
、s
i
受曲线测量绝对强度影响。
[0019]
4、本发明采用每个特征点数据项与曲线段数据项相乘后累加的形式s
j*
×
f
j*
s
i*
×
f
i*
，充分发挥不同光合荧光参数对毒性物质存在不同程度响应这一特性，扩大光合荧光参数检测毒性物质的种类范围。
[0020]
5、本发明利用ojip曲线中j、i特征位点的出现时间t
fj
、t
fi
对特征位点数据项f
j*
、f
i*
进行修正，利用o
‑
j和j
‑
i段曲线过程时间段长度t
fj
‑
t
f0
、t
fi
‑
t
f0
对两个曲线段数据项s
j*
和s
i*
进行修正，提高物质毒性的检测稳定性和灵敏度。
[0021]
6、本发明根据毒性物质胁迫时，藻类光合作用的电子传递过程被阻断，从而导致ojip曲线中特征位点荧光强度和曲线上升过程变化这一生物原理，分别计算实际水体实验组与空白对照组综合毒性参数pi’cte
和pi
cte
，计算出综合毒性参数变化率η，从而判断待测水体物质毒性强度。
附图说明
[0022]
图1：ojip曲线及相关荧光参数；
[0023]
图2(a)不同浓度敌草隆胁迫下fv/fm、pi
cte
响应趋势图；
[0024]
图2(b)不同浓度2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌胁迫下fv/fm、pi
cte
响应趋
势图；
[0025]
图2(c)不同浓度甲基紫精胁迫下fv/fm、pi
cte
响应趋势图；
[0026]
图2(d)不同浓度马拉硫磷胁迫下fv/fm、pi
cte
响应趋势图；
[0027]
图2(e)不同浓度克百威胁迫下fv/fm、pi
cte
响应趋势图。
具体实施方式
[0028]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域的普通技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。
[0029]
根据本发明的实施例，本发明通过分析ojip中o、j、i、p特征位点对毒性物质的响应特点，提出了一种基于多参数融合的光合抑制效应表征参数pi
cte
的构建方法。该方法选择以f
j
、f
i
、s
j
、s
i
为基础，通过归一化处理，并采用求和方式融合j、i点荧光强度信息和o
‑
j、j
‑
i曲线上升过程信息，同时利用加权的思想，根据j、i点对毒性物质响应灵敏度的差异为各位点数据项分配权重，构建反映藻类光合抑制效应的表征参数pi
cte
。
[0030]
根据本发明的一个实施例，以普通小球藻为受试藻种，研究在五种常见水体污染物敌草隆、2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌、甲基紫精、马拉硫磷、克百威胁迫下，fv/fm、pi
cte
两个光合荧光参数在检测毒性物质的性能差异，验证pi
cte
参数在毒性检测中的有效性。具体包括如下步骤：
[0031]
步骤1：测定叶绿素荧光上升动力学曲线ojip，并获取f0、f
j
、f
i
、f
m
光合荧光参数；
[0032]
步骤2：利用最大最小值归一化方法对f
j
、f
i
进行归一化处理得两个特征位点数据项f
j*
、f
i*
，提取曲线中j点与i点信息，并消除其受荧光测量绝对强度影响；
[0033]
步骤3：利用定积分分别计算ojip曲线在[t
f0
,t
fj
]、[t
f0
,t
fi
]、[t
f0
,t
fp
]区间内与f＝f0构成封闭区域的包围的面积s
j
、s
i
、s
p
；即s
j
为ojip曲线中o、j、t
f0
、t
fj
四点所构成封闭区域的包围面积，s
i
为ojip曲线中o、i、t
f0
、t
fi
四点所构成封闭区域的包围面积，s
p
为ojip曲线中o、i、t
f0
、t
fp
四点所构成封闭区域的包围面积；
[0034]
步骤4：利用s
p
对s
j
、s
i
进行归一化处理得两个曲线段数据项s
j*
、s
i*
，提取o
‑
j和j
‑
i段曲线上升过程信息，并消除其受曲线测量绝对强度影响；
[0035]
步骤5：根据f
j*
、f
i*
、s
j*
、s
i*
计算结果以及t
f0
、t
fj
、t
fi
、t
fj
‑
t
f0
、t
fi
‑
t
f0
，利用公式(1)计算得到综合表征参数pi
cte
；
[0036][0037]
其中，f
j*
、f
i*
分别为归一化后ojip曲线中j、i点荧光强度，t
f0
、t
fj
、t
fi
、t
fp
分别为o、j、i、p点所对应的时间，s
j*
、s
i*
分别为归一化后o
‑
j、o
‑
i段曲线与f＝f0构成封闭区域的面积；
[0038]
步骤6：根据上述步骤1
‑
5分别计算实际水体实验组与空白对照组综合毒性参数pi’cte
和pi
cte
，计算出综合毒性参数变化率η，判断待测水体物质毒性强度，变化率越大表明水体综合毒性越强。
[0039][0040]
具体的，步骤1、测定叶绿素荧光上升动力学曲线ojip，并获取f0、f
j
、f
i
、f
m
光合荧光参数；其中，f0、f
j
、f
i
、f
m
的获取具体如下：
[0041]
测定叶绿素荧光上升动力学曲线ojip，记录从20μs
‑
2s的荧光数据。如表1所示，通过计算ojip曲线上不同时间下的荧光值得到f0、f
j
、f
i
、f
m
。
[0042]
表1 f0、fj、fi、fm参数基本描述
[0043][0044][0045]
具体的，所述步骤2：利用最大最小值归一化方法对f
j
、f
i
进行归一化处理得两个特征位点数据项f
j*
、f
i*
，提取曲线中j点与i点信息，并消除其受荧光测量绝对强度影响；其中，f
j
、f
i
归一化处理如下：
[0046]
采用最大最小值归一化方法(min
‑
max normalization)(如公式(2)所示)对原始j、i点荧光进行等比例缩放，式(2)中x为待归一化数据、min、max分别为参数x取值范围的最小值与最大值，x
*
为x归一化后的数值。在完整的ojip曲线中，最小值为f0，最大值为f
m
，故归一化后的j、i点荧光值分别如公式(3)、(4)所示。
[0047][0048][0049][0050]
所述步骤3、利用定积分分别计算ojip曲线在[t
f0
,t
fj
]、[t
f0
,t
fi
]、[t
f0
,t
fp
]区间内与f＝f0构成封闭区域的包围的面积s
j
、s
i
、s
p
；
[0051]
所述步骤4：利用s
p
对s
j
、s
i
进行归一化处理得两个曲线段数据项s
j*
、s
i*
，提取o
‑
j和j
‑
i段曲线上升过程信息，并消除其受曲线测量绝对强度影响；
[0052]
利用o
‑
j、o
‑
i段ojip曲线与f＝f0构成封闭区域的面积s
j
、s
i
，ojip曲线与f＝f0包围的最大面积，即o
‑
p段曲线包围面积s
p
，进一步计算o
‑
j、o
‑
i段曲线包围面积在最大包围面积下的相对面积；最后利用s
p
对s
j
、s
i
进行归一化处理得两个曲线段数据项s
j*
、s
i*
，提取o
‑
j和j
‑
i段曲线上升过程信息，并消除其受曲线测量绝对强度影响，其中s
j
、s
i
、s
p
、s
j*
、s
i*
计算方式如公式(5)、(6)、(7)、(8)、(9)所示：
[0053][0054]
[0055][0056][0057][0058]
步骤5：根据f
j*
、f
i*
、s
j*
、s
i*
计算结果以及t
f0
、t
fj
、t
fi
、t
fj
‑
t
f0
、t
fi
‑
t
f0
，利用公式(1)计算得到综合表征参数pi
cte
；具体如下：
[0059]
对j、i特征点信息f
j*
、f
i*
，以及o
‑
j和j
‑
i段曲线过程信息s
j*
、s
i*
融合，融合方法采用每个特征点数据项与曲线段数据项相乘后累加的形式：s
j*
×
f
j*
s
i*
×
f
i*
。在此基础上，将各特征位点数据项f
j*
、f
i*
分别除以各自的出现时间t
fj
、t
fi
，对j、i特征点数据项进行修正；将两个曲线段数据项s
j*
、s
i*
分别除以各自对应的时间段长度t
fj
‑
t
f0
、t
fi
‑
t
f0
，对o
‑
j和j
‑
i曲线段数据项进行修正，从而构建水体综合毒性表征参数pi
cte
：
[0060][0061]
根据本发明的实施例，采用本发明的方法对水体毒性进行检测。
[0062]
按照公式(1)分别计算水体实验组与空白对照组综合毒性参数pi’cte
和pi
cte
，根据公式(2)计算出水体综合毒性参数变化率η，判断待测水体物质毒性强度，以综合毒性参数变化率η及毒性物质的浓度建立毒性响应的剂量效应关系曲线，实现对水体污染物毒性强度的定量分析。
[0063]
以普通小球藻为受试藻种，研究在五种常见水体污染物敌草隆、2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌、甲基紫精、马拉硫磷、克百威胁迫下，fv/fm、pi
cte
两个光合荧光参数在检测毒性物质的性能差异，验证pi
cte
参数在毒性检测中的有效性。
[0064]
根据本发明的实施例，对本发明的方法与传统方法进行比较，包括检测范围、最低检测限、最高检测限；具体如下：
[0065]
1、检测范围
[0066]
根据普通小球藻在五种毒性物质胁迫下实验结果，利用单因素方差分析(one
‑
anova)方法分别计算fv/fm、pi
cte
的响应与对照组之间的显著性差异，比较两个光合荧光参数对五种毒性物质的检测能力。在毒性物质测试浓度范围内，当高于某一测试浓度时，对照组与实验组荧光参数之间观察到显著性差异(p<0.05),则说明该荧光参数具有检测这一物质的能力，结果如表2所示。
[0067]
表2 fv/fm、pi
abs
、pi
cte
对五种毒性物质响应与对照组的差异性分析结果
[0068][0069][0070]
注：*、**分别代表对照组与实验组光合荧光参数在0.05和0.01水平上有差异。
[0071]
由表2可知，敌草隆、2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌、甲基紫精对fv/fm、pi
cte
的作用效果明显，分别在1μg/l、100μg/l、5mg/l浓度时两个荧光参数与对照组相比已具有显著变化(p<0.05)；马拉硫磷、克百威仅表现出对pi
cte
的显著作用，在5μg/l浓度时，即表现出显著差异，而fv/fm在不同浓度马拉硫磷、克百威胁迫下实验组与对照组结果均无显著差异(p>0.05),该结果表明fv/fm不具备检测马拉硫磷、克百威的能力，在检测毒性物质范围上，fv/fm与pi
cte
相比可检测的污染物种类较少。
[0072]
2、最低检测限
[0073]
在五种毒性物质低浓度胁迫下进行实验，分别计算fv/fm、pi
cte
的抑制/促进率，建立剂量效应曲线。根据国际纯粹与应用化学联合会(iupac)对最低检测限的定义(见公式8)，采用低浓度下的线性剂量效应曲线计算各个荧光参数对毒性物质的最低检测限。
[0074][0075]
其中，s
b
为空白样品多次测量响应信号的标准偏差(本研究中空白样品重复测量20次)；m为线性剂量效应曲线的斜率。
[0076]
表3 fv/fm、pi
cte
对五种毒性物质的最低检测限
[0077][0078]
注：(
‑
)代表参数对毒性物质无响应。
[0079]
如表3所示，pi
cte
对五种毒性物质的检测限更低，对低浓度毒性物质的检测能力更强，如fv/fm、pi
cte
对敌草隆的最低检测限分别为2.70、0.90μg/l，pi
cte
的检测限显著低于fv/fm，相较于fv/fm降低了66.7％。
[0080]
3、最高检测限
[0081]
根据五种毒性物质高浓度胁迫下实验结果，分别建立fv/fm、pi
cte
的剂量效应曲线，在毒性物质测试浓度范围内，当高于某一测试浓度时，毒性表征参数变化率到达阈值或趋于平稳，则该测试浓度为参数检测上限。
[0082]
fv/fm、pi
cte
在五种毒性物质胁迫下的剂量效应曲线如图2所示，根据剂量效应趋势分别计算两个光合荧光参数对五种毒性物质的检测上限，如当2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌浓度小于5mg/l时，fv/fm变化率随着2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌浓度的增加呈逐渐上升趋势，而当2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌浓度大于20mg/l时，fv/fm已趋于平稳。因此以fv/f为响应指标，则其对2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌的最高响应浓度均为20mg/l。而对于pi
cte
，当2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌浓度在1
‑
40mg/l范围内时，pi
cte
变化率随2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌浓度的增加而增大，当2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌的浓度达到分析浓度的最大值40mg/l时，pi
cte
变化率也并没有达到阈值或趋于平稳，因此以pi
cte
为响应指标，则其对2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌的最高响应浓度大于40mg/l，与fv/fm相比，pi
cte
对2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌具有更高的最高响应浓度。
[0083]
按照同样的分析方法，将以fv/fm、pi
cte
两种光合荧光参数为响应指标的敌草隆、2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌、甲基紫精、马拉硫磷、克百威五种毒性物质最高响应浓度列于表4中，从整体来看pi
cte
对五种毒性物质的检测上限最高，检测能力均在mg/l，对高浓度毒性物质的检测能力最强。
[0084]
表4 fv/fm、piabs、picte对五种毒性物质的检测上限
[0085][0086]
综上，结果表明：在毒性检测方面，本发明以所构建pi
cte
作为响应指标，对五种毒性物质均响应灵敏，与fv/fm相比可检测马拉硫磷、克百威等更多种类的污染物；pi
cte
对敌草隆、2,5
‑
二溴
‑6‑
异丙基
‑3‑
甲基
‑
1,4
‑
苯醌、甲基紫精的最低检测限分别比fv/fm降低了66.7％、14.4％和22.9％，同时对高浓度毒性物质的检测能力更强。该研究为研究高灵敏、高精度水体综合毒性检测方法提供了重要毒性表征参数。
[0087]
尽管上面对本发明说明性的具体实施方式进行了描述，以便于本技术领域的技术人员理解本发明，且应该清楚，本发明不限于具体实施方式的范围，对本技术领域的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本发明的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本发明构思的发明创造均在保护之列。