一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及基因工程和分子生物学技术领域，特别是涉及一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器及其制备方法和应用。


背景技术：

2.生物感应技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或者特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件包括基因转录启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等等；而报告元件可在感应元件的作用下而产生感应信号，一般常用的报告元件包括绿色荧光蛋白(gfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、红色荧光蛋白(rfp)和荧光素酶，分别产生对应颜色的荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这些较为常见的报告元件的特点是技术成熟、容易操作，但是荧光和自发光的检测需要借助于分析仪器，还需要对荧光信号和自发光信号进行定量和定性分析。
3.爆炸物(例如地雷)的有效成份为2,4,6
‑
三硝基甲苯(tnt)，tnt可自然分解为多种化合物，如1,3
‑
二硝基苯(1,3
‑
dnb)和2,4
‑
二硝基甲苯(2,4
‑
dnt)，其中2,4
‑
dnt的稳定性最高，可在自然环境中长期存在。以色列科学家shimshon belkin于2014年报道了对爆炸物分子2,4
‑
dnt的感应元件，即yqjf启动子，利用gfp作为报告元件，构建了检测2,4
‑
dnt的生物感应系统，检测限达到0.01mg/l(new biotechnology,2020,59,65
‑
73)，处于国际上领先水平。此生物感应系统需使用仪器进行特定波长的紫外激发，以及绿色荧光信号的收集。另外，多种非gfp物质都能在紫外激发下发出绿色荧光，从而产生干扰信号。因此，该传感器的特异性较差，大大限制了其在复杂环境中的应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，该爆炸物分子感应器能够实现对爆炸物分子的实时荧光检测。
5.为实现上述发明目的，本发明提供了如下方案：
6.本发明提供一种利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器的制备方法，包括以下步骤：
7.(1)扩增自发光操纵子luxabcde operon基因片段、纯化回收后，与质粒pacycduet
‑
1同时使用not i和kpn i进行双酶切，将luxabcde operon基因片段与质粒酶切片段以2
‑
5:1的摩尔比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的lb固体平板上筛选阳性克隆，验证并测序正确后得到重组质粒p
‑
luxpleio；
8.(2)扩增启动子nahr基因片段，纯化回收后，其与重组质粒p
‑
luxpleio利用psti进
行单酶切，将质粒酶切片段与nahr基因片段以2
‑
5:1的摩尔比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的lb固体平板上筛选阳性克隆，验证并测序正确后得到重组质粒p
‑
nahr
‑
luxpleio；
9.(3)扩增调控蛋白rsrr与teth启动子基因片段，纯化回收后，其与重组质粒p
‑
nahr
‑
luxpleio利用noti进行单酶切，将质粒酶切片段与rsrr
‑
p
teth
基因片段以2
‑
5:1的摩尔比进行连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的lb固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p
‑
nahr
‑
rsrr
‑
p
teth
‑
luxpleio；
10.(4)将重组质粒p
‑
nahr
‑
rsrr
‑
p
teth
‑
luxpleio转化大肠杆菌感受态细胞，于含抗生素的lb固体平板上筛选阳性克隆，得到工程菌株mr
‑
12；
11.(5)将工程菌株mr
‑
12于含抗生素的lb液体培养基中培养活化，再转接至以葡萄糖为碳源且含有镁离子的m9液体培养基中培养，得到利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器。
12.在步骤(2)之后，还包括步骤(2
‑
1)，将重组质粒p
‑
nahr
‑
luxpleio转化大肠杆菌感受态细胞，于含氯霉素的lb固体平板上筛选阳性克隆，得到工程菌株mr
‑
11；
13.以及步骤(2
‑
2)，将工程菌株mr
‑
11于含抗生素的lb液体培养基中培养活化，再转接至以葡萄糖为碳源且含有镁离子的m9液体培养基中培养，初步得到一种爆炸物分子生物传感器。
14.进一步地，在步骤(2
‑
2)中，将工程菌株mr
‑
11于含氯霉素的lb液体培养基中培养活化，再转接至添加了60％葡萄糖和1m硫酸镁溶液的m9液体培养基中培养生长至od
600
＝0.2，初步得到一种爆炸物分子生物传感器。
15.进一步地，所述自发光操纵子luxabcde operon来源于：鲾鱼发光杆菌。
16.进一步地，所述自发光操纵子luxabcde operon具有下列核苷酸序列之一：
17.seq id no.1所示的核苷酸序列；
18.或，与seq id no.1所示的核苷酸序列具有90％以上同源性，且能够编码自发光表型的核苷酸序列。
19.进一步地，所述启动子nahr的核苷酸序列如seq id no.2所示。
20.进一步地，所述调控蛋白rsrr与teth启动子的核苷酸序列如seq id no.3所示。
21.进一步地，在步骤(5)中，将工程菌株mr
‑
12于含氯霉素的lb液体培养基中培养活化，再转接至添加了60％葡萄糖和1m硫酸镁溶液的m9液体培养基中培养生长至od
600
＝0.2，得到利用调控元件合成的爆炸物分子生物传感器。
22.本发明还提供一种上述的利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器的制备方法制备得到的利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器。
23.本发明还提供一种上述的利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器在用于爆炸物分子的实时检测中的应用。
24.本发明还提供一种利用上述的利用调控元件合成的爆炸物分子生物感应器实时检测爆炸物分子的方法，包括：
25.将爆炸物分子生物感应器与待测样品以9:1的体积比混匀后，加入黑色酶标板后封闭，一方面利用科研级ccd相机进行曝光30s的拍照检测；另一方面利用酶标仪恒温实时监测荧光强度rlu值，每10
‑
20min进行一次监测，共监测15
‑
25h。
26.进一步地，所述爆炸物分子生物感应器能够感应到的爆炸物分子的浓度为10μg/l，所述爆炸物分子为2,4
‑
dnt。
27.进一步地，所述爆炸物分子生物感应器能够感应不同浓度的爆炸物分子，从而发成不同强度的自发光，将爆炸物分子浓度与自发光值进行偶联来达到实时监测爆炸物分子的目的。
28.本发明公开了以下技术效果：
29.1、本发明将含有鲾鱼发光杆菌lux操纵子的报告质粒作为基础质粒，通过连接能够感应2,4
‑
dnt的启动子，得到重组质粒后转入大肠杆菌细胞中，初步得到一种能够感应爆炸物分子的生物感应器，再将嗜酸喜温硫细菌调控蛋白rsrr及其下游调控的teth启动子连接到之前构建好的重组质粒中，将带有rsrr
‑
p
teth
的重组质粒转入大肠杆菌细胞中，最终得到一种利用调控系统感应爆炸物分子的生物感应器，这种生物传感器能够感应不同浓度的爆炸物分子，从而产生不同程度的荧光信号，通过检测产生荧光的强烈程度可达到检测爆炸物分子的目的，检测结果准确、高效，使用简单。
30.2、本发明构建的利用rsrr
‑
p
teth
调控元件合成的爆炸物分子生物感应器，能够在nahr启动子感应爆炸物分子后，启动调控蛋白rsrr的转录，rsrr调控蛋白再作用于teth启动子，启动luxabcde报告基因的表达，使得nahr启动子感应爆炸物分子的信号通过rsrr
‑
p
teth
调控级联放大，增强感应爆炸物分子后产生的荧光信号，提高检测的灵敏性，在实地检测爆炸物方面具有很大的应用前景。
附图说明
31.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
32.图1为构建的载体p
‑
luxpleio的质粒图谱。
33.图2为构建的载体p
‑
nahr
‑
luxpleio的质粒图谱。
34.图3为构建的载体p
‑
nahr
‑
rsrr
‑
p
teth
‑
luxpleio的质粒图谱。
35.图4为构建的工程菌株mr
‑
11酶标仪检测结果。
36.图5为构建的工程菌株mr
‑
11酶标仪检测结果。
37.图6为构建的工程菌株mr
‑
11和mr
‑
12相机检测结果。
具体实施方式
38.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
39.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
40.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
41.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
42.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
43.在生物体内，调控蛋白能够将环境刺激等信号通过调控作用级联扩大，并最终在下游结构基因的转录表达中进行体现，最终实现生物体各种生理活动的应答和协调。研究发现，嗜酸性喜温硫杆菌(acidithiobacillus caldus，简称a.caldus)中存在负责硫代硫酸盐及连四硫酸盐代谢的teth基因簇，该基因簇前存在一个rsrr调控蛋白能够作用于teth基因的启动子，激活teth基因簇的转录表达，将环境信号级联放大，最终实现硫代硫酸盐及连四硫酸盐的生理代谢活动。
44.因此，本发明利用rsrr
‑
pteth调控系统元件构建爆炸物分子生物感应器，该生物感应器能够在nahr启动子感应爆炸物分子后，启动调控蛋白rsrr的转录表达，rsrr调控蛋白再作用于teth启动子，启动luxabcde报告基因的表达，使得nahr启动子感应爆炸物分子的信号通过rsrr
‑
p
teth
调控元件级联放大，增强感应爆炸物分子后产生的荧光信号，进而被仪器检测，从而完成了本发明。
45.实施例1基因的获得和载体的构建
46.1、基因的获得
47.将来源于鲾鱼发光杆菌(photobacterium leiognathi)的luxabcde operon，其核苷酸序列如seq id no.1所示，由华大基因公司化学合成至puc
‑
57载体上，获得puc
‑
lumpleio载体。
48.将来源于恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)的nahr启动子基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示，由华大基因公司化学合成至puc
‑
57载体上，获得puc
‑
nahr载体。
49.将来源于嗜酸性喜温硫杆菌(acidithiobacillus caldus)mth
‑
04的rsrr调控蛋白teth启动子其核苷酸序列如seq id no.3所示，由华大基因公司化学合成至puc
‑
57载体上，获得puc
‑
rsrr
‑
p
teth
载体。
50.其中，seq id no.1：
51.atgattaagaagatcccaatgattattgggggtgtagttcaaaacacgtctggatatggcatgcgtgaactaacgctcaacaataataaagtgaatatccctatcatcacccaaagtgatgttgaagctattcaatcactaaatatagaaaacaaattgactataaatcagatagttaatttcttatatacagtgggacaaaaatggaagagcgaaacttacagccgacgactcacttatattcgagatcttattaagttcctcggttactcacaagagatggcaaaacttgaagctaactggatctcaatgattctgtgtagcaaaagtgcgttgtacgatattgttgagaatgatcttagctcacggcatattattgatgagtggatcccccaaggtgaatgttatgtcaaagcgctcccaaaaggaaaatctgtacacctattagctggtaacgtaccactatctggtgtgacttctattcttcgtgcgattttgaccaaaaacgagtgcatcataaaaac
gtcatcagctgatccttttacagctactgcgctagttaatagttttatcgatgtagatgcagaacacccgatcacacgttcaatctcagttatgtattggtcacatagcgaggatcttgctattccaaaacaaataatgagctgtgctgatgtggttattgcatggggtggtgatgatgcaattaaatgggctacagaacatgcaccatcacacgcagatattctaaaatttggtcccaaaaagagtatatccattgttgacaacccaacagatattaaggctgctgctatcggtgtagcacatgatatctgtttttacgatcagcaagcatgtttctccacccaagatatttattatattggcgatagcatagacatattttttgatgaattagctcagcaattaaataaatataaagacatattgcctaaaggtgagcggaattttgatgaaaaagcagctttttctttaacggaaagagaatgtttgtttgccaaatataaagttcaaaaaggtgaaagccaatcttggttattaacgcaatcacctgcgggatcatttggtaatcagccgttatcacgctcggcttatattcatcaagtaaatgacatttcagaagtcattccattcgtgcataaggcggtaacgcaaaccgtcgcaatagcgccgtgggagtcgtctttcaaatatagagatatattagcagaacatggtgcagaacgaattatagaagccggaatgaataatatatttcgagtaggtggcgcccatgatgggatgcgtccccttcaacggcttgttaactatatatcacatgaaaggccgtcaacatataccactaaagatgtctcggtgaaaatcgaacagactcgttatcttgaggaagataagttcctcgtatttgtaccgtagaaagagatatatcatggaaaatacacaacattcattacctattgatcacgtaattgatattggtgataaccgttatattcgagtatgggaaaccaagccgaaaaataaagaaaccaagcgtaataataccatcgttatcgcctcaggctttgctcgacgcatggatcattttgctggtcttgccgaatatttagcaaataatggttttcgtgttattcgttatgattcgttaaatcatgtcggtcttagtagcggagagatcaaacagttctcgatgtcagtaggtaaacacagtttgctaactgttattgattggctaaaagaacgaaatattaacaatataggtcttattgcttcgagtctttctgctcgaattgcttatgaagtggcagcagaaattgatttgtcatttttaattaccgccgtcggtgttgtcaatttaagaagtacgctagaaaaagcactgaaatatgattatctacaaatggaagtaaatactattcctgaagatttaatttttgaaggacacaatctaggttcaaaagtctttgtgacagattgttttgaaaataattgggactcattagattcgacaataaataaaatttgtgaactagatattccatttattgctttcacttcagatggcgatgattgggtttgccaacatgaagtaaaacatttagtcagtaacgttaaatctgacaaaaagaaaatttactcactcgttggctcatctcatgatttgggcgaaaacctagtggtgcttcgtaacttctatcaatcaatgacgaaagctgctgtgagcttagatcgtcaattagtagagcttgttgatgaaattattgaaccaaattttgaagacctaacagttattacggtaaatgaacggcgcctcaaaaataaaatcgaaaatgaaattattaatagattagctgatcgcgtattggctagtgtctaaatagtacttacctaagtacagccaaaaggaagaaataatgaaaattagtaatatctgtttctcataccaaccaccaggtgaatcacatcaagaggtaatggagcgctttattcgtttaggcgttgcatcagaagagctcaactttgatggtttctatacacttgaacaccatttcactgagtttggtattacaggtaacctttatattgcctgtgccaatattcttggtcgaaccaaaaggatccaagtcggtaccatggggatagtgttaccgacagagcacccagcacgacatgtagaaagtcttctcgttttagatcaactgtctaaagggcgctttaactacggtactgttcgcggactctaccataaagattttcgtgtttttggtacatcacaggaagattctcgtaagaccgcagaaaatttctactctatgatcttggatgcatcaaaaacaggtgtgctacatactgacggtgaagtagtagagttcccagatgtcaatgtttatccagaagcttacagcaaaaaacaacccacctgcatgacagccgaatcatccgagaccatcacttatttagctgaacgtggtttaccaatggtgttaagttggattattccggtcagtgagaaagtctcacaaatggaattgtacaatgaagttgcggcagagcatggtcatgacattaacaacattgaacatatcctaactttcatttgctctgtaaatgaagacggtgaaaaagcagacagcgtatgccgtaatttcctagaaaattggtacgactcttacaaaaatgcaaccaacatcttcaacgacagtaaccaaactcgtggctacgattacctcaaagctcagtggcgtgagtgggtaatgaaggggttggctgatcctcgtcgccgacttgattacagtaacgaattaaaccctgtcggcacgccagaacgatgcattgagatcattcaaagtaatattgatgccactggaattaagcatattactgttggatttgaagcgaatggttctgaacaagaaattcgtgaatccatggagctatttatggaaaaagtagcgccacacttaaaa
gatcctcagtaagctgttctttttaaactattcaatatcaaggcataaggaataaaatatgaatttcgggttatttttcctaaatttccagcctgaaggtatgacttcagaaatggttttagacaacatggtagatactgtcgcattagtggataaagatgattaccactttaaaagagtgctcgtcagcgagcatcatttttctaaaaacggcattatcggagaacctttgacagcgattagcttcttacttggtttgactaaacgtatagaaattggttctttaaatcaagtgattaccacccatcatcctgtacgtatcggagaacaaacgggcttacttgatcaaatgtcttacggtcgtttcgttttaggcttaagtgactgtgtcaatgacttcgaaatggatttctttaagagaaaacgtagctctcaacagcaacaattcgaagcatgttacgaaattttaaatgaagcgctgacgacaaactattgtcaggcagatgatgacttctttaacttcccacgtatttctgttaacccgcattgtattagcgaagtaaaacaatatattttagcttcaagcatgggcgtggttgaatgggcagcaagaaaaggattgccactcacttaccgctggagtgacagcctagcagaaaaagaaaaatactatcagcgttatctcgctgttgctaaagagaataatattgatgtatcaaatattgaccaccaattcccactgctcgttaatatcaatgaaaatcgtcgtattgctcgagatgaagtaagggagtatatacaaagttatgtgagtgaagcctaccctactgaccccaacattgagctaagagtagaagagcttattgagcagcatgctgtcggcaaagtggatgagtactacgactcaacaatgcacgcagtaaaagttacaggttcaaaaaatttattactctcttttgaatcaatgaaaaataaagacgatgttaccaagcttataaatatgtttaatcaaaaaatcaaagataaccttattaaataatttaattacggatagatattttcgatatatctaagtcttactaccatttatataaactatttatacagataacgtttcatttgattaagtcagtaaataattgccattaattaatggcagtgcagatccttacactgccatttataaattaaataagggttaacatgtcaacattattaaatatagatgcaactgaaattaaggtgagtacagaaatagatgatattatttttacatcatcaccgctaacgttactatttgaagatcaagaaaaaatacagaaagaacttattttggagtctttccattatcattacaatcataataaagattataagtactattgtaatatacaaggcgtagatgagaatatacagtccattgacgatattcctgtttttcctacttcaatgttcaagtactcaagattacatactgctgatgaatcaaatattgaaaattggtttactagtagtggtacaaagggagtcaaaagtcatatagctcgagatcggcagagtattgaacgcttgctaggttctgttaattacggcatgaaatacttgggtgaatttcacgagcatcaattagaactagtgaatatggggccagatcgtttcagtgcgtcaaatgtttggtttaaatatgtaatgagcttagttcaattactttacccaacaacatttaccgttgaaaacgatgaaatcgattttgaacaaaccatcttagcgttaaaagcaattcagcgtaaaggaaaaggaatttgtttaattggccctccgtattttatttatttgttatgccactacatgaaagagcataatatcgaatttaatgctggtgcacatatgtttatcattacaggtgggggatggaaaaccaaacaaaaagaagcgctaaaccgacaagatttcaatcaactattgatggagacttttagccttttccatgaaagtcaaattcgagatatctttaaccaagtagagctaaacacttgtttctttgaagacagcctacagcgtaaacatgtaccaccgtgggtatatgctcgtgcgcttgatcctgtcactttaacgcccgtagaagatggccaagagggcttgatgagttatatggatgcctcatctaccagctacccgacatttattgttaccgacgatattggtattgttcgccatctaaaagaaccagatccattccaaggaacaacggttgaaattgttcgtcgtttaaatacgcgagaacaaaaaggatgttcactctcaatggccacgagcctgaaataaaagcagggcttaatcatgatttttaattgcaaggttaaaaaagtcgaagcatctgacagccatatttacaaagtgtttattaagcctgacaaatgctttgattttaaagcgggtcaatatgtaattgtgtatctcaatggaaaaaatttgccgttttctattgctaactgcccaacttgtaatgagctccttgaattacatgtaggaggttcggtaaaagaatccgccattgaagctatttcgcactttattaatgcatttatttatcaaaaagaatttacaatcgatgcaccacacggtgatgcatggctgagagatgaaagccaatcacctttactacttatagcaggagggacaggtttatcatatatcaatagcattttaagttgttgtattagtaaacagttatctcagcctatctatctttattggggagtaaataactgtaatttactctatgctgatcaacaactaaaaacactcgccgcacaatacagaaatataaattatattcctgtggtagagaatttaaatactgactggcagggaaaaattggtaatgttattgacgcggttattgaagatttttcagatttatctgactttgatatctatgtctgcgggccatttggtatgagc
cggactgcgaaagatattctgatctcacagaaaaaggcgaatataggaaaaatgtattctgatgcatttagctatacgtaa；
52.seq id no.2：
53.cgcatacctcgcctttgtgaacctctaattaccactgactctatccgggctttgcccgttagaccatcagtgggcattaatagtcgacatgcttgtcatcgattgggcacctgactttccctgcgattggtccccctaaacccgtgcagggtaacagcctttggccttaagattcacctctgccccacattaggcgaagcgcaccg；
54.seq id no.3：
55.atggaaatcaaatcttccgcacacattctggtggttgacgacgatttacggctacggagtctggtggaagcacacctccgtcaggtggggtttactgtcgacggagtgcgtgatggccaaggactcgatcataaacttcacgggggggaggtagatttgatcatactcgatttgggcttgcccgatgaggatggtcttcagatttgtcagcgcctacgcctgacatacgatacccctatcctgatactgacggcccgtggggatgaggtggatcgcatacttgggttggagatgggcgccgacgattacctatcaaaaccttttcatccacgggagttaatcgctcgtgttcaggctatactgcgaagaacaaagcccatgaacaggggtcgccagcacgccgatgagccagaaatatgtatgaagggcgcttttgtggtggacacgcgccgtcaaaaaattctgtggcggggagaaccgttagagttatcacaagccgattttcagacactttctacgcttatcaagcacgagggacaaccgctcagtcgggaacggctcatgcttctgagtcggggccgaacctatgcgtcggatgaccgaaccatagacatgcagatctcgcgattacgaaagctactcgattccaaaaccgacggtgctcagcacattcgcacagtatggggtagcggatacatgtttctctccgaaccatgaaggtccggtttcttcttgttgatcgtggtacgcatctcgaagcgccgattgtgtacagaatgaacagtggcgagtctgctcggcaacccggacatgggatgggaatcgggttgatgatttgtcatcgcatcatggcattgcacaagggctctttgcatttcacatcagaggatgggctggcggcaaccatttgccttccgagagtacaagatggagtaacatcggcacagagacaggaattcaacgcacgtaaattgtaacacctgttacacctgttacaacttgttacataagctaaaacttatatgcaattgtctcctatgggccccgagtatactatccgaagcgcggcgtagttatgcccctagacaacgtattagcgattcggagattatatatc。
56.2、p
‑
lumpleio表达载体的构建
57.以puc
‑
lumpleio为模版，引物lumpleio
‑
f和引物lumpleio
‑
r，进行聚合酶链式反应(pcr)，扩增lumpleio片段，其pcr扩增体系如下表所示：
[0058][0059][0060]
pcr程序为：95℃3min；30循环
×
(95℃15s，58℃15s，72℃6min)；72℃5min；16℃∞。
[0061]
引物序列如下所示：
[0062]
lumpleio
‑
f(seq id no.4)：
[0063]5’‑
tcgacaagcttgcggccgcatgattaagaagatcccaatg
‑3’
；
[0064]
lumpleio
‑
r(seq id no.5)：
[0065]5’‑
taccagactcgagggtaccttacgtatagctaaatgcatca
‑3’
。
[0066]
pcr产物利用胶回收纯化试剂盒(vazyme，货号dc301
‑
01)进行胶回收纯化。
[0067]
利用限制性内切酶1not i(takara，货号1611)和限制性内切酶2kpn i(takara，货号1615)双酶切pacycduet
‑
1质粒，其酶切体系为：
[0068][0069]
酶切体系置于37℃孵育1h，进行胶回收纯化。
[0070]
利用无缝克隆将luxpleio片段克隆到pacycduet
‑
1质粒上，其体系如下所示：
[0071][0072]
连接体系置于50℃孵育30min。连接产物转化e.coli dh5α感受态，涂布到含34mg/l氯霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p
‑
luxpleio(图1)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
[0073]
3.p
‑
nahr
‑
luxpleio表达载体的构建
[0074]
以puc
‑
nahr为模版，引物nahr
‑
f和引物nahr
‑
r，进行聚合酶链式反应(pcr)，扩增nahr片段，其pcr扩增体系如下所示：
[0075][0076]
pcr程序为：95℃3min；30循环
×
(95℃15s，55℃15s，72℃30s)；72℃5min；16℃∞。引物序列如下所示：
[0077]
nahr
‑
f(seq id no.6)：
[0078]5’‑
gagctcggcgcgcctgcagcgcatacctcgcctttgtgaa
‑3’
；
[0079]
nahr
‑
r(seq id no.7)：
[0080]5’‑
caagcttgtcgacctgcagcggtgcgcttcgcctaatgt
‑3’
。
[0081]
pcr产物利用胶回收纯化试剂盒(vazyme，货号dc301
‑
01)进行胶回收纯化。
[0082]
利用限制性内切酶pst i(takara，货号1073)酶切p
‑
luxpleio质粒，其酶切体系为：
[0083][0084]
酶切体系置于37℃孵育1h，进行胶回收纯化。
[0085]
利用无缝克隆将nahr片段克隆p
‑
luxpleio质粒上，其体系如下所示：
[0086][0087][0088]
连接体系置于50℃孵育30min。连接产物转化e.coli dh5α感受态，涂布到含34mg/l卡那霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p
‑
nahr
‑
luxpleio(图2)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
[0089]
3、p
‑
nahr
‑
rsrr
‑
p
teth
‑
luxpleio表达载体的构建
[0090]
以puc
‑
rsrr
‑
p
teth
为模版，引物rsrr
‑
pteth
‑
f和引物rsrr
‑
pteth
‑
r，进行聚合酶链式反应(pcr)，扩增nahr片段，其pcr扩增体系如下所示：
[0091][0092]
pcr程序为：95℃3min；30循环
×
(95℃15s，55℃15s，72℃1min)；72℃2min；16℃∞。引物序列如下所示：
[0093]
rsrr
‑
pteth
‑
f(seq id no.8)：
[0094]5’‑
tcgacaagcttgcggccgcatggaaatcaaatcttccgc
‑3’
；
[0095]
rsrr
‑
pteth
‑
r(seq id no.9)：
[0096]5’‑
ttcttaatcatgcggccgcgatatataatctccgaatcg
‑3’
。
[0097]
pcr产物利用胶回收纯化试剂盒(vazyme，货号dc301
‑
01)进行胶回收纯化。
[0098]
利用限制性内切酶not i(takara，货号1611)酶切p
‑
nahr
‑
luxpleio质粒，其酶切体系为：
[0099][0100][0101]
酶切体系置于37℃孵育1h，进行胶回收纯化。
[0102]
利用无缝克隆将rsrr
‑
p
teth
片段克隆p
‑
nahr
‑
luxpleio质粒上，其体系如下所示：
[0103][0104]
连接体系置于50℃孵育30min。连接产物转化e.coli dh5α感受态，涂布到含34mg/
l卡那霉素的lb固体平板上，pcr筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p
‑
nahr
‑
rsrr
‑
p
teth
‑
luxpleio(图3)，再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
[0105]
实施例2生物感应器的构建
[0106]
将p
‑
nahr
‑
luxpleio和p
‑
nahr
‑
rsrr
‑
p
teth
‑
luxpleio两种重组质粒转化入escherichia coli bw25113感受态细胞(购买自weidi biotechnology，货号dl2050)，涂布到含34mg/l氯霉素的lb固体平板上，通过pcr筛选获得阳性克隆，由此获得含有载体p
‑
nahr
‑
luxpleio的工程菌株mr
‑
11和含有载体p
‑
nahr
‑
rsrr
‑
p
teth
‑
luxpleio的工程菌株mr
‑
12。
[0107]
实施例3生物感应器检测爆炸物分子的应用
[0108]
1、菌株活化和培养
[0109]
将测序正确的工程菌株mr
‑
11和mr
‑
12分别转接至含有34mg/l氯霉素的lb液体培养基中，37℃培养过夜。将过夜活化的菌液吸取200μl转接到10ml m9液体培养基中，m9液体培养基中加入10μl 34mg/ml氯霉素、330μl 60％葡萄糖和10μl 1m硫酸镁储存液，37℃摇床培养至od
600
＝0.2左右。
[0110]
2、配制2,4
‑
dnt溶液
[0111]
配制20mg/ml母液2,4
‑
dnt(100mg 2,4
‑
dnt溶于5ml无水乙醇)；
[0112]
按以下比例配制稀释后的2,4
‑
dnt溶液：
[0113]
50mg/l：2.5μl母液 980μl m9培养基 17.5μl无水乙醇；
[0114]
10mg/l：0.5μl母液 980μl m9培养基 19.5μl无水乙醇；
[0115]
0mg/l：980μl m9培养基 20μl无水乙醇。
[0116]
配制0.2mg/ml 2,4
‑
dnt稀释母液(10μl 20mg/ml的2,4
‑
dnt母液加990μl无水乙醇)；
[0117]
按以下比例配制稀释后的2,4
‑
dnt溶液：
[0118]
1mg/l：5μl稀释母液 980μl m9培养基 15μl无水乙醇；
[0119]
使得各dnt溶液中乙醇的浓度为2％，稀释10倍后乙醇的终浓度为0.2％。
[0120]
3、爆炸物分子检测
[0121]
取90μl菌液与10μl各浓度(0mg/l、0.1mg/l、1mg/l、10mg/l、100mg/l)的2,4
‑
dnt母液混合，加至96孔黑色酶标板(costar，货号3603)中，使得2,4
‑
dnt的终浓度分别为0mg/l、0.01mg/l、0.1mg/l、1mg/l、10mg/l，
[0122]
酶标仪检测：用酶标仪(biotek)恒温30℃实时监测mr
‑
11和mr
‑
12两种菌株的荧光强度(rlu)，每10min进行一次检测，共监测12h。
[0123]
结果如图4和图5所示，工程菌株mr
‑
11和mr
‑
12在不同的爆炸物分子浓度下的发光强度都呈现一种先随时间增强，到达最高值后再随时间逐渐减弱的趋势。到达最高值的时间都位于6h左右，但带有p
‑
nahr
‑
rsrr
‑
p
teth
‑
luxpleio质粒的工程菌株mr
‑
12发光强度最大值约为带有p
‑
nahr
‑
luxpleio质粒工程菌株mr
‑
11的2倍。
[0124]
相机检测：将黑色酶标板工程菌株放入恒温30℃环境下培养6h，再将培养后的工程菌株放入暗室中，使用科研级ccd相机进行拍照检测，曝光时间为30s。
[0125]
检测将如图6所示，培养6h后，工程菌株mr
‑
12的发光强度比工程菌株mr
‑
11明显提高。
[0126]
以上结果表明本发明制备的工程菌株mr
‑
12在感应爆炸物分子时的发光强度比工程菌株mr
‑
11高2倍以上，有效的扩大了工程菌株在检测低浓度爆炸物分子时的荧光信号，提高了检测结果的准确性和可靠性。
[0127]
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。