一种可填充用的丝素蛋白凝胶的制备及应用的制作方法

1.本发明属于生物医用领域，具体为一种可填充用的丝素蛋白凝胶的制备及应用。


背景技术：

2.蚕丝由丝素蛋白和丝胶蛋白构成，属于天然蛋白纤维。其中丝素蛋白占蚕丝整体质量的75％左右，富含18种氨基酸，具有良好的力学性能、生物相容性、可降解性。研究表明，丝素蛋白在单独使用时，不会诱导免疫反应，在生物医用领域具有深远的应用前景。从物理性能看，丝素蛋白在可控条件下可以实现水溶性与非水溶性的双向转化的特点，使其可通过不同工艺溶解再生成特定形态的生物医用材料，如微球、纤维膜、凝胶等，可广泛应用于药物载体、伤口敷料、皮肤填充材料或其他组织工程方面。
3.注射填充用丝素蛋白水凝胶在医学美容领域具有可观的应用前景。凝胶是由亲水的高分子化合物通过物理或者化学方法制得的一种三维网络聚合物。其相互连通的多孔结构为细胞的迁移和增殖提供了良好的环境，可以实现组织的原位再生及重建。此外，丝素蛋白在人体内会逐渐降解，此过程主要由蛋白酶介导，降解产物多肽可由细胞完全代谢，对人体无毒副作用。当下，提高注射用丝素蛋白凝胶的填充效果和使用安全性具有重要的现实意义。
4.当前，虽然已经公开了一些丝素蛋白凝胶技术，但都是通过新鲜的丝素蛋白溶液制备而成，将冷冻干燥后的丝素蛋白直接完全溶解是一个技术难题。专利号cn 103289107 a公开了一种可注射丝素蛋白原位凝胶的制备方法及其应用，将质量分数为3
‑
30％的丝素蛋白水溶液与质量分数为50
‑
100％的聚乙二醇或丙二醇溶液进行混合，两者体积比为2:1
‑
1:2，该共混液经1
‑
10min凝固形成丝素蛋白凝胶。专利号cn 112574436 a公开了一种丝素蛋白和聚多巴胺的复合凝胶的制备方法，将脱胶丝素蛋白、氯化钙和甲酸混合加热溶解后得到丝素蛋白溶液，待溶液冷却至室温20
‑
25℃并静置至甲酸挥发完，得到丝素蛋白凝胶。以上技术都利用丝素蛋白溶液去制备凝胶，这涉及到溶液的制备及存储问题，故将冻干后的丝素蛋白直接溶解成凝胶具有重要的现实意义。


技术实现要素：

5.针对上述问题，本发明提供了一种可填充用的丝素蛋白凝胶的制备方法，采用简单的工艺配方将再生高分子丝素蛋白制备成生物相容性良好的凝胶。
6.一种可填充用的丝素蛋白凝胶的制备方法，主要包括以下步骤：
7.称取一定质量的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入一定量的纯化水使得丝素蛋白浓度为30
‑
50mg/ml，机械搅拌1
‑
10min后，边搅拌边加入一定量的氯化钠和利多卡因，继续搅拌30
‑
120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
8.优选方案为，氯化钠浓度为0.5％
‑
1.5％，氯化钠与利多卡因的质量比为1:1
‑
10:1。
9.优选方案为，所述丝素蛋白呈絮状，分子量达200万以上，采用碱法脱胶和离子液
体溶解法制备而得。
10.优选方案为，所述碱法脱胶和离子液体溶解法的具体步骤为：将蚕茧剪碎放入三口烧瓶中，再放入质量分数为2g/l的碳酸氢钠溶液，控制浴比为1:100，煮沸并冷凝回流30min，最后用温和的蒸馏水水洗至没有滑腻感，烘干后得到丝素蛋白；将质量分数为1％的丝素蛋白加到1
‑
乙基
‑3‑
甲基咪唑醋酸盐离子液体中，油浴加热并磁力搅拌至丝素蛋白完全溶解后得到离子液体溶液；经超声后，快速离心除去未溶解的杂质得到丝素蛋白透明溶液，再加入一定量的纯化水至丝素蛋白完全析出，水洗后放入电热鼓风干燥箱中干燥12h得到超纯高分子丝素蛋白。
11.上述任一制备方法所得到的丝素蛋白凝胶在填充材料领域的应用。
12.与现有技术相比，本发明的特点和有益效果是：
13.1.优化配方、溶解快：本发明在丝素蛋白凝胶制备的过程中引入了氯化钠，通过中性盐的离子键破坏高分子丝素蛋白之间的分子间作用力及静电排斥，从而加快了丝素蛋白的溶解；
14.2.浓度高、填充效果好：本发明溶解丝素蛋白大分子时加入了氯化钠，有利于破坏高分子内部的分子间作用力及静电排斥，使缠结的大分子链得以舒展，从而大大提高了丝素蛋白凝胶的浓度，在实际应用中填充效果更佳；
15.3.安全性高、填充剂可回收：在出现注射失误的情况下，浓度提升后的丝素蛋白凝胶填充剂更易于通过注射器回收，使用更安全。
具体实施方式
16.以下结合具体实施方式对本发明作进一步说明。下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如无特别说明，下述所用各成分的含量为重量百分比含量。
17.实施例中所用到的实验材料及设备来源见表1和表2
18.表1主要实验材料与规格
[0019][0020]
表2主要实验设备与规格：
[0021][0022]
实施例1称取0.6g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为30mg/ml，机械搅拌1min后，边搅拌边加入0.18g氯化钠，使得氯化钠浓度为0.9％，再加入0.03g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为6:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解
的丝素蛋白凝胶。
[0023]
实施例2称取0.6g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为30mg/ml，机械搅拌10min后，边搅拌边加入0.18g氯化钠，使得氯化钠浓度为0.9％，再加入0.03g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为6:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0024]
实施例3称取1.0g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为50mg/ml，机械搅拌1min后，边搅拌边加入0.18g氯化钠，使得氯化钠浓度为0.9％，再加入0.03g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为6:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0025]
实施例4称取1.0g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为50mg/ml，机械搅拌10min后，边搅拌边加入0.18g氯化钠，使得氯化钠浓度为0.9％，再加入0.03g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为6:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0026]
实施例5称取0.8g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为40mg/ml，机械搅拌1min后，边搅拌边加入0.1g氯化钠，使得氯化钠浓度为0.5％，再加入0.017g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为6:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0027]
实施例6称取0.8g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为40mg/ml，机械搅拌10min后，边搅拌边加入0.1g氯化钠，使得氯化钠浓度为0.5％，再加入0.017g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为6:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0028]
实施例7称取0.8g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为40mg/ml，机械搅拌1min后，边搅拌边加入0.3g氯化钠，使得氯化钠浓度为1.5％，再加入0.05g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为6:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0029]
实施例8称取0.8g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为40mg/ml，机械搅拌10min后，边搅拌边加入0.3g氯化钠，使得氯化钠浓度为1.5％，再加入0.05g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为6:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0030]
实施例9称取0.8g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为40mg/ml，机械搅拌5min后，边搅拌边加入0.1g氯化钠，使得氯化钠浓度为0.5％，再加入0.1g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为1:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0031]
实施例10称取0.8g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为40mg/ml，机械搅拌5min后，边搅拌边加入0.1g氯化钠，使得氯化钠浓度为0.5％，再加入0.01g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为10:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0032]
实施例11称取0.8g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为40mg/ml，机械搅拌5min后，边搅拌边加入0.3g氯化钠，使得氯化钠浓度为1.5％，再加入
0.3g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为1:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0033]
实施例12称取0.8g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为40mg/ml，机械搅拌5min后，边搅拌边加入0.3g氯化钠，使得氯化钠浓度为1.5％，再加入0.03g利多卡因，此时氯化钠与利多卡因的质量比为10:1，继续搅拌120min后，得到充分溶解的丝素蛋白凝胶。
[0034]
实施例13(作为对照样)
[0035]
称取0.6g的丝素蛋白于圆底烧瓶中，加入20ml纯化水使得丝素蛋白浓度为30mg/ml，机械搅拌1min后，边搅拌边加入0.03g利多卡因，继续搅拌120min后，得到浑浊有絮状物的丝素蛋白溶液。
[0036]
由实施例1
‑
13中的成胶现象可知，1
‑
12实施例均可得到充分溶解的丝素蛋白凝胶，而13实施例中丝素蛋白并没有完全溶解，可见氯化钠的引入可以促进丝素蛋白的溶解。原因在于中性氯化钠可以中和丝素蛋白大分子之间的作用力和静电排斥，使得大分子链可以由缠结状态变为舒展，从而促进了丝素蛋白的溶解成胶。下面对1
‑
12实施例中的凝胶样品进行热原、细胞毒性、皮肤填充及降解试验评价，具体测试方案和结果如下：
[0037]
热原试验：参照gb/t 16886.11
‑
2011提供的方法进行热原试验，随机选取36只日本大耳白兔，将其分为12组，每组各3只，试验结果以每组3只兔子的体温升高总值来表示，编号1
‑
12依次对应实施例1
‑
12中制备得的丝素蛋白凝胶，试验结果如下表3所示。
[0038]
表3各实施例对应的热原试验数据表
[0039][0040]
由表3数据可知，本发明实施例1
‑
12所制备的丝素蛋白凝胶的升温总和范围为0.1
‑
0.3℃，均满足热原试验合格要求，可见其生物相容性良好。
[0041]
细胞毒性试验：参照gb/t 16886.5
‑
2017提供的mtt方法进行体外细胞毒性试验，采用l929小鼠成纤维细胞作为细胞系。试验液的制备如下：用10％胎牛血清的mem培养液将实施例1
‑
12中的丝素蛋白凝胶填充剂按3cm2/ml的比例在37℃下浸提24h得到待测液；同批含10％胎牛血清的mem培养液作为空白对照液；将高密度聚乙烯膜按3cm2/ml的比例加入含10％胎牛血清的mem培养液，在37℃浸提24h后的浸提液作为阴性对照液；10％的二甲基亚砜(dmso)作为阳性对照液；最后通过细胞存活率进行毒性评级。如存活率下降到空白的70％以下，则具有潜在的细胞毒性。细胞毒性评级分为0
‑
4级：其中0代表无毒，1代表轻微，2代表轻度，3代表中度，4代表重度。各样品的细胞存活率及毒性评价见下表4。
[0042]
表4实施例样品和对照样品的细胞存活率及毒性评级表
[0043]
样品细胞存活率(％)细胞毒性评级毒性程度196.590级无296.890级无392.350级无
496.180级无595.290级无694.780级无796.770级无893.290级无991.890级无1096.240级无1193.750级无1292.580级无空白对照液99.800级无阴性对照液99.460级无阳性对照液12.184级重度
[0044]
由表4数据可知，本发明实施例中的丝素蛋白凝胶试验液经mtt细胞毒性测试后细胞存活率仍可高达96.89％，所制备的凝胶对小鼠成纤维细胞的毒性评价可达0级，即无毒，可见本发明实施例中所制备的注射填充材料具有良好的生物相容性。
[0045]
皮肤填充及降解时间试验：将上述实施例1
‑
12所制备的丝素蛋白凝胶填充剂注射到豚鼠皮内进行注射填充实验，具体方式为：取36只豚鼠，平均分为12组，每个实施例注射3只豚鼠作为平行对照。注射方法如下：取0.2ml上述实施例中制备的凝胶填充剂分别植入豚鼠背部皮肤内，在1
‑
7天内观察是否有红肿、皮下结节等不良反应出现，并长期观察填充植入后的降解情况，试验结果如下表5所示：
[0046]
表5实施例1
‑
12的凝胶填充剂在注射后的反应及降解情况
[0047]
[0048]
[0049][0050]
由表5数据可知，本发明实施例中所制备的丝素蛋白凝胶填充材料注射至豚鼠皮下，无明显红肿、皮下结节等不良反应，其在皮肤组织中降解时间长达9
‑
12个月，具有良好的生物相容性和可降解性，对临床应用具有实用价值。
[0051]
综上所述，本发明突出的特点在于采用直接溶解法将再生高分子丝素蛋白制备成可填充用的凝胶，制备工艺简单且生物相容性良好。
[0052]
当然，本发明的上述实施例仅为说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述举例的基础上还可以做其他不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以详细举例。凡是属于本发明的技术方案所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。