氰基乙酰胺及其有关物质的检测方法与流程

1.本发明涉及检测方法领域，特别是涉及氰基乙酰胺及其有关物质的检测方法。


背景技术：

2.氰基乙酰胺为白色粉末状结晶体，通常由氰乙酸甲酯与氨作用而得，可溶于多种有机溶剂和水，有毒，是一种重要的有机合成中间体，可用于合成丙二腈和电镀液，还用于合成药物氨苯蝶啶、氨蝶呤、米力农等。
3.作为重要的合成起始物料，氰基乙酰胺的质量直接影响到后续反应中间体甚至终产物的质量，因此氰基乙酰胺的质量控制对于后续的终产品质量控制方面具有重要的意义。
4.目前，针对氰基乙酰胺的质量控制方法已有报道，由于氰基乙酰胺极性较大，在反相色谱条件下，其在c18柱或c8柱上的保留很弱，几乎是在死时间出峰，因此最初氰基乙酰胺的检测多采用气相或正相色谱法。
5.如在专利cn103926333a中，提供了一种氰基乙酰胺含量测定方法，使用正相高效液相色谱法，流动相为乙腈
‑
一氯甲烷混合溶液，检测器为蒸发光散射检测器(elsd)；魏泱等也采用高效液相正相色谱法对氰基乙酰胺进行检测，流动相为乙醇和正己烷(正相高效液相色谱法测定氰基乙酰胺，现代农药，2014年6月第13卷第3期)。
6.但此类方法操作均比较复杂，需要平衡的时间较长，这给分析工作带来许多不便，且正相色谱法使用的溶剂毒性较大、挥发性强，会损害操作人员的健康。
7.为了改进氰基乙酰胺的检测方法，cn111413451a公开了一种采用反相高效液相色谱法检测氰基乙酰胺的方法，流动相为乙腈
‑
甲酸铵，检测波长200nm，供试品中氰基乙酰胺浓度为0.5mg/ml。
8.该方法虽然实现了氰基乙酰胺的反相高效液相色谱法检测，缩短了检测过程的操作时间，相对于正向色谱法简化了一些操作步骤，但其流动相的配制需要先调节甲酸铵溶液的ph值，再与乙腈以一定比例混合，配制繁琐，仍然存在操作复杂的问题，这也直接导致实验过程的不确定因素多，重现性较差，并且，流动相中仍然使用了乙腈这类属于限制使用的二类溶剂，环境不友好，仍然会损害操作人员的健康。
9.由此可见，如何通过反相高效液相色谱法，高效便捷、绿色安全地实现氰基乙酰胺的检测，有待进一步开发改进和完善。
10.另外，氰基乙酰胺的生产工艺为化学合成，则不可避免会引入一些工艺杂质，同时在存储过程中，也会产生部分降解杂质。但对于氰基乙酰胺中的有关物质种类，尚无文献报道，这也导致了氰基乙酰胺质量控制过程中的局限性，仅能够对氰基乙酰胺进行检测和控制，若能够研究出氰基乙酰胺的有关物质并对其进行质量控制，必然能更好地保障氰基乙酰胺及其后续产品的质量。


技术实现要素：

11.本发明的目的在于提供一种氰基乙酰胺和/或其有关物质的检测方法，可对氰基乙酰胺更好地进行质量控制。
12.氰基乙酰胺作为重要的医药中间体，对其进行质量控制具有重要的实际意义，目前氰基乙酰胺虽已被广泛使用，但未有任何氰基乙酰胺有关物质的相关研究，进而也未有任何与氰基乙酰胺有关物质的检测相关的研究报道，不能够从氰基乙酰胺及其相关物质两方面对氰基乙酰胺进行全面地质量控制。
13.导致该现状的原因主要是，作为氰基乙酰胺的有关物质，其化学结构和性质与氰基乙酰胺具有一定的相似性，在反向色谱法中大多也存在色谱柱上保留很弱、死时间出峰的问题，很难实现有关物质相互之间的有效分离、鉴定和检测。
14.另外，氰基乙酰胺及其有关物质的化学结构决定了其紫外吸收均较弱，易导致检测的灵敏度不足，对于含量很低的杂质化合物，即使实现了有效分离也很容易漏检而无法检出。因此，对于氰基乙酰胺相关物质的研究难度较大。
15.经过不断地研究探索，本发明发明人成功分离鉴定出现有工艺(通过氰乙酸甲酯与氨作用得到)合成的氰基乙酰胺的两种相关物质：氰乙酸、氰乙酸甲酯。
16.氰基乙酰胺、氰乙酸、氰乙酸甲酯的结构如下：
[0017][0018]
在此基础上，发明人开发了新的检测方法，能够将氰基乙酰胺、氰乙酸、氰乙酸甲酯有效分离并实现同时检测，进而可对氰基乙酰胺进行更好的质量控制。
[0019]
本发明提供了一种氰基乙酰胺和/或其有关物质的检测方法，采用高效液相色谱进行定性或/和定量检测，液相色谱的检测条件包括：
[0020]
色谱柱：c18或等效色谱柱；
[0021]
流动相：磷酸水溶液。
[0022]
发明人通过大量的实验验证，在本发明的检测条件下，流动相中磷酸水溶液在常见的合理使用范围内，如磷酸体积分数0.005～0.5％时，均可实现主峰与杂质峰相互之间的有效分离，达到检测目的。
[0023]
当流动相中磷酸浓度过高时，会对色谱柱造成损害，降低色谱柱的性能和使用寿命，因此，本领域作为流动相的磷酸水溶液中磷酸的体积分数通常控制在0.005～0.2％的范围内。
[0024]
在本发明的具体实施方式中，针对使用的色谱柱ph值，为了保证色谱柱不受损伤，将磷酸水溶液中磷酸的体积分数控制不大于0.16％，具体使用的流动相为体积分数0.01～0.16％的磷酸水溶液，优选为体积分数0.1％的磷酸水溶液。
[0025]
进一步地，所述有关物质至少包括氰乙酸、氰乙酸甲酯中的一种或两种。
[0026]“至少包括氰乙酸、氰乙酸甲酯中的一种或两种”，是指，有关物质可以仅为氰乙酸或氰乙酸甲酯，也可以为氰乙酸和氰乙酸甲酯，也可以是氰乙酸(或氰乙酸甲酯)和其它杂质，还可以是氰乙酸、氰乙酸甲酯和其它杂质等。
[0027]
进一步地，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
[0028]
i色谱柱规格：4.6
×
250mm，3～5μm；
[0029]
ii柱温：25～40℃；
[0030]
iii流速：0.5～1.0ml/min；
[0031]
iv检测波长：200nm～230nm。
[0032]
进一步地，所述液相色谱检测条件还包括以下的i～iv中的一项或多项：
[0033]
i色谱柱规格：4.6
×
250mm，5μm；
[0034]
ii柱温：30℃；
[0035]
iii流速：0.5～0.8ml/min，优选0.6ml/min；
[0036]
iv检测波长：210
±
2nm；
[0037]
进一步地，进样量为5～50μl。
[0038]
在本发明的具体实施方式中，进样量为20μl。
[0039]
进一步地，色谱柱采用可耐受100％水相的c18色谱柱或等效色谱柱。
[0040]
针对本发明的色谱柱，发明人尝试过市面上多种可耐受100％水相的c18色谱柱商品，包括但不限于waters xbridge c18、ultimate aq
‑
c18、ymc
‑
pack ods
‑
aq、安捷伦poroshell 120bonus
‑
rp、安捷伦poroshell 120sb
‑
aq、安捷伦zorbax sb
‑
aq、polaris c18
‑
a、zorbax bonus
‑
rp、zorbax sb
‑
aq、岛津inertsustain aq
‑
c18，均可实现氰基乙酰胺、氰乙酸、氰乙酸甲酯有效检测的技术效果。在本发明的具体实施方式中，记载的是采用ymc
‑
pack ods
‑
aq色谱柱的实施方式。
[0041]
当然，应当理解为本发明可选的色谱柱不仅限于上述商品，上述色谱柱商品仅是对可行技术方案的示例列举，不能因此限定本发明的保护范围，凡是满足前述限定或与上述商品等效的色谱柱均可实现本发明。
[0042]
进一步地，本发明检测方法还包括制备供试品溶液，包括如下步骤：将供试品与稀释剂混合。
[0043]
进一步地，所述稀释剂为体积分数0.005～0.5％的磷酸水溶液，优选为体积分数0.005～0.2％的磷酸水溶液，优选为体积分数0.01～0.16％的磷酸水溶液，更优选为体积分数0.1％的磷酸水溶液。
[0044]
在实际操作中，为了操作简便，可使所述稀释剂与流动相保持一致。
[0045]
进一步地，所述供试品溶液的浓度为10mg/ml～60mg/ml，优选为20mg/ml～50mg/ml，更优选为20mg/ml～30mg/ml，更优选为25mg/ml。
[0046]
所述检测方法可使用面积归一化法、自身对照法、内标法、外标法等方法分析等本领域内常用的方法计算检测结果。
[0047]
在本发明的具体实施方式中，采用外标法计算氰乙酸、氰乙酸甲酯含量，采用自身对照法计算其他杂质含量。
[0048]
本发明的有益效果是：
[0049]
(1)本发明首次发现、鉴定出氰基乙酰胺的两种有关物质：氰乙酸和氰乙酸甲酯，对氰基乙酰胺的质量控制研究具有重要意义。
[0050]
(2)本发明检测方法实现了氰基乙酰胺、氰乙酸、氰乙酸甲酯的有效分离，可同时对氰基乙酰胺及其有关物质进行质量控制，打破了以往仅能检测氰基乙酰胺进行质量控制的局限性，更全面地保障了氰基乙酰胺的质量安全，为氰基乙酰胺的质量控制提供了可靠
的方法。
[0051]
(3)本发明检测方法采用单一水相，无需调节ph值，操作方便，影响因素少，重现性好；流动相不含有机相，绿色环保，可更好地保障操作人员的健康；系统适用性和专属性佳，线性良好；灵敏度高，可准确检出氰基乙酰胺原料中含量很低的有关物质(工艺杂质氰乙酸定量限1.9μg/ml，氰乙酸甲酯定量限0.98μg/ml)；准确度和耐用性好，可更好地对氰基乙酰胺相关产品进行质量控制，值得推广应用。
附图说明
[0052]
图1是氰基乙酰胺的紫外吸收图；
[0053]
图2是氰乙酸的紫外吸收图；
[0054]
图3是氰乙酸甲酯的紫外吸收图；
[0055]
图4是条件1色谱条件的检测谱图；
[0056]
图5是条件2色谱条件的检测谱图(供试品浓度：0.5ml/min)；
[0057]
图6是条件2色谱条件的检测谱图(供试品浓度：0.6ml/min)；
[0058]
图7是条件2色谱条件的检测谱图(供试品浓度：0.8ml/min)；
[0059]
图8是条件2色谱条件的检测谱图(供试品浓度：1.0ml/min)；
[0060]
图9是氰乙酸对照品在条件2色谱条件下的检测谱图(供试品浓度：0.6ml/min)；
[0061]
图10是氰基乙酸甲酯对照品在条件2色谱条件下的检测谱图(供试品浓度：0.6ml/min)；
[0062]
图11是条件3色谱条件的检测谱图(柱温：25℃)；
[0063]
图12是条件3色谱条件的检测谱图(柱温：35℃)；
[0064]
图13是条件3色谱条件的检测谱图(柱温：40℃)；
[0065]
图14是实施例3色谱条件的检测谱图(流动相：体积分数0.01％磷酸水溶液)；
[0066]
图15是实施例3色谱条件的检测谱图(流动相：体积分数0.16％磷酸水溶液)；
[0067]
图16是实施例4色谱条件的检测谱图(供试液浓度：10mg/ml)；
[0068]
图17是实施例4色谱条件的检测谱图(供试液浓度：30mg/ml)；
[0069]
图18是实施例4色谱条件的检测谱图(供试液浓度：40mg/ml)；
[0070]
图19是实施例4色谱条件的检测谱图(供试液浓度：50mg/ml)；
[0071]
图20是实施例4色谱条件的检测谱图(供试液浓度：60mg/ml)；
[0072]
图21是氰基乙酰胺的线性图；
[0073]
图22是氰乙酸甲酯的线性图；
[0074]
图23是氰乙酸的线性图。
[0075]
具体实施方法
[0076]
下面通过具体实施方式和实验对本发明检测方法做进一步说明。
[0077]
实施例中相关实验操作如下：
[0078]
供试品溶液的制备：称取氰基乙酰胺样品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含25mg样品的溶液。
[0079]
对照品溶液制备：取氰乙酸甲酯对照品、氰乙酸对照品适量，精密称定，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含1.25mg对照品的溶液，作为对照品溶液贮备液；精密量取
对照品溶液贮备液适量，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含125μg对照品的溶液。
[0080]
自身对照溶液制备：精密量取供试品溶液适量，加稀释剂制成每1ml中约含25μg供试品的溶液。
[0081]
系统适用性溶液：精密量取供试品溶液与对照品溶液贮备液适量，加稀释剂稀释制成每1ml中约含供试品、氰乙酸甲酯、氰乙酸各125μg的溶液。
[0082]
实施例1检测波长的选择
[0083]
分别对氰基乙酰胺、氰乙酸甲酯、氰乙酸的紫外吸收波长进行检测，结果如图1～3，化合物在200nm～230nm范围内均有较强吸收，最终选择210nm为检测波长进行后续实验。
[0084]
实施例2色谱条件的筛选
[0085]
条件1：
[0086]
色谱柱：waters symmetry c18，4.6
×
250mm，5μm；
[0087]
流动相：磷酸水溶液(体积分数0.11％)
‑
甲醇(v/v＝80:20)；
[0088]
柱温：30℃
[0089]
检测波长：210nm；
[0090]
进样量：20μl；
[0091]
稀释剂：流动相；
[0092]
供试液浓度：10mg/ml；
[0093]
流速：0.8ml/min。
[0094]
检测结果如图4所示。
[0095]
根据图4所示，主峰保留时间2.890min，且无法检出氰乙酸和氰乙酸甲酯等杂质化合物，需进一步调整色谱条件。
[0096]
条件2：
[0097]
色谱柱：ymc
‑
pack ods
‑
aq，4.6
×
250mm，5μm；
[0098]
流动相：质量分数0.1％磷酸水溶液；
[0099]
柱温：30℃；
[0100]
检测波长：210nm；
[0101]
进样量：20μl；
[0102]
稀释剂：流动相；
[0103]
供试液浓度：25mg/ml；
[0104]
流速：
[0105]
分别设置流速为0.5ml/min、0.6ml/min、0.8ml/min、1.0ml/min。
[0106]
检测结果如表1和图5～8所示。
[0107]
表1
[0108]
[0109]
根据表1结果可知，本条件更换色谱柱和流动相后，可以很好地检出杂质氰乙酸和氰乙酸甲酯，灵敏度高，且能够实现杂质之间与主峰的有效分离。当流速为0.5～1.0ml/min时，主峰氰基乙酰胺、氰乙酸、氰乙酸甲酯相互之间能够良好地有效分离，不同流速的分离效果无太大差别。综合考虑分析时间、样品保留因素，选择流速为0.6ml/min。
[0110]
条件3：
[0111]
色谱柱：ymc
‑
pack ods
‑
aq，4.6
×
250mm，5μm；
[0112]
流动相：体积分数0.1％磷酸水溶液；
[0113]
柱温：
[0114]
分别设置流速为25℃、30℃(直接采用条件2中数据)、35℃、40℃；
[0115]
检测波长：210nm；
[0116]
进样量：20μl；
[0117]
稀释剂：流动相；
[0118]
供试液浓度：25mg/ml；
[0119]
流速：0.6ml/min。
[0120]
检测结果如表2和图6和图11～13所示。
[0121]
表2
[0122][0123]
根据表2结果可知，柱温对分离影响较小，可选择常规柱温30℃。
[0124]
最终确定的优选色谱条件为：
[0125]
色谱柱：ymc
‑
pack ods
‑
aq，4.6
×
250mm，5μm；
[0126]
流动相：体积分数0.1％磷酸水溶液；
[0127]
柱温：30℃；
[0128]
检测波长：210nm；
[0129]
进样量：20μl；
[0130]
稀释剂：流动相；
[0131]
供试液浓度：25mg/ml；
[0132]
流速：0.6ml/min。
[0133]
检测结果见图6。
[0134]
实施例3
[0135]
色谱条件：
[0136]
色谱柱：ymc
‑
pack ods
‑
aq，4.6
×
250mm，5μm；
[0137]
流动相：分别采用磷酸体积分数为0.01％、0.16％的磷酸水溶液；
[0138]
柱温：30℃；
[0139]
检测波长：210nm；
[0140]
进样量：20μl；
[0141]
稀释剂：流动相；
[0142]
供试液浓度：25mg/ml；
[0143]
流速：0.6ml/min；
[0144]
检测结果图谱见图14、15。
[0145]
图14为流动相为体积分数0.01％磷酸水溶液时供试品中氰基乙酰胺与氰乙酸、氰乙酸甲酯的分离色谱图，主峰氰基乙酰胺(6.534min)与相邻的杂质氰乙酸(8.483min)分离度为5.87。
[0146]
图15为流动相为体积分数0.16％磷酸水溶液时供试品中氰基乙酰胺与氰乙酸、氰乙酸甲酯的分离色谱图，主峰氰基乙酰胺(6.519min)与相邻的杂质氰乙酸(8.283min)分离度为5.88。
[0147]
通过上述结果可知，在本发明的检测条件的流动相，不同磷酸浓度范围均可实现有效检测，只要是磷酸水溶液即可，但在磷酸体积分数大于0.16％时，流动相ph值低于aq柱的ph值范围，会对色谱柱造成损伤，在实际应用中通常采用体积分数小于等于0.16％的磷酸水溶液做流动相。
[0148]
实施例4
[0149]
色谱条件：
[0150]
色谱柱：ymc
‑
pack ods
‑
aq，4.6
×
250mm，5μm；
[0151]
流动相：体积分数0.1％磷酸水溶液；
[0152]
柱温：30℃；
[0153]
检测波长：210nm；
[0154]
进样量：20μl；
[0155]
稀释剂：流动相；
[0156]
供试液浓度：10mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml；
[0157]
流速：0.6ml/min。
[0158]
检测结果图谱见图16～20。
[0159]
图16是供试液浓度为10mg/ml时供试品中氰基乙酰胺与氰乙酸、氰乙酸甲酯的分离色谱图，主峰氰基乙酰胺(6.607min)与相邻的杂质氰乙酸(8.269min)分离度为6.51。
[0160]
图17是供试液浓度为30mg/ml时供试品中氰基乙酰胺与氰乙酸、氰乙酸甲酯的分离色谱图，主峰氰基乙酰胺(6.523min)与相邻的杂质氰乙酸(8.249min)分离度为5.50。
[0161]
图18是供试液浓度为40mg/ml时供试品中氰基乙酰胺与氰乙酸、氰乙酸甲酯的分离色谱图，主峰氰基乙酰胺(6.504min)与相邻的杂质氰乙酸(8.234min)分离度为5.16。
[0162]
图19是供试液浓度为50mg/ml时供试品中氰基乙酰胺与氰乙酸、氰乙酸甲酯的分离色谱图，主峰氰基乙酰胺(6.521min)与相邻的杂质氰乙酸(8.220min)分离度为4.81。
[0163]
图20是供试液浓度为60mg/ml时供试品中氰基乙酰胺与氰乙酸、氰乙酸甲酯的分离色谱图，主峰氰基乙酰胺(6.521min)与相邻的杂质氰乙酸(8.206min)分离度为4.54，分离稍变差，色谱柱过载较严重。
[0164]
方法学验证(实施例2中的优选条件)：
[0165]
1、氰基乙酰胺溶液的稳定性：
[0166]
表3
[0167][0168]
2、线性方程
[0169]
氰基乙酰胺线性：
[0170]
表4
[0171]
线性溶液名称浓度(mg/ml)相当于样品溶液的百分比(％)峰面积l60.001223640.0055901l50.002447280.0111132l40.00611820.0227450l30.01529550.0670079l20.0305910.12138949l10.0611820.24273910
[0172]
线性方程：y＝4,478,458x 679，r2＝0.9999，线性范围0.001mg/ml～0.06mg/ml，见图21。
[0173]
氰乙酸甲酯线性：
[0174]
表5
[0175][0176][0177]
线性方程：y＝823380x
‑
512，相关系数r＝0.99995，斜率823380，截距相当于100％浓度的4.6％，线性范围0.001mg/ml～0.057mg/ml，见图22。
[0178]
氰乙酸线性：
[0179]
表6
[0180]
线性溶液名称浓度(mg/ml)相当于样品溶液的百分比(％)峰面积l60.001258750.0051154l50.00251750.014712l40.006293750.0258898l30.0157343750.0615375l20.031468750.1231248
l10.06293750.2571546
[0181]
线性方程：y＝1104326x 30，相关系数r＝0.996，斜率1104326，截距相当于100％浓度的0.1％，线性范围0.001mg/ml～0.06mg/ml，见图23。
[0182]
氰乙酸甲酯校正因子＝4478458/823380＝5.44。
[0183]
氰乙酸校正因子＝4478458/1104326＝4.06。
[0184]
氰乙酸甲酯、氰乙酸校正因子均超过或接近5，故均使用外标法检测。
[0185]
3、检测限、定量限：
[0186]
氰乙酸甲酯：
[0187]
检测限浓度0.00057mg/ml，相当于样品供试液的0.0023％，连续进样三次，s/n范围在4.0～8.2之间。
[0188]
定量限浓度0.0019mg/ml，相当于样品供试液的0.0076％，连续进样六次，s/n范围在11.5～16.7之间，峰面积平均值21.016(岛津)，峰面积rsd 0.33％。
[0189]
氰乙酸：
[0190]
检测限浓度0.00029mg/ml，相当于样品供试液的0.0012％，连续进样三次，s/n范围在4.4～6.7之间。
[0191]
定量限浓度0.00098mg/ml，相当于样品供试液的0.0039％，连续进样六次，s/n范围在16.7～33.5之间，峰面积平均值905(岛津)，峰面积rsd 0.14％。
[0192]
氰基乙酰胺：
[0193]
检测限未进行。
[0194]
定量限：未做到s/n为10左右。线性实验时做到最低浓度0.00122mg/ml，相当于样品供试液的0.005％，s/n范围在162.8～168.2之间。峰面积平均值5900(岛津)。
[0195]
4、耐用性：
[0196]
表7
[0197][0198]
5、系统适用性
[0199]
多次进行系统适用性检测，氰乙酸甲酯和氰乙酸乙酯的检测数据见表8。
[0200]
表8
[0201]
名称峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4峰面积rsd/％
氰乙酸甲酯131841376814205145614.3氰乙酸227092279822634226690.3
[0202]
6、专属性
[0203]
表9
[0204][0205]
结果表明，本发明方法的系统适用性和专属性佳，线性良好，线性范围、检测限和定量限均符合要求，准确度和耐用性好，证明该方法适合氰基乙酰胺及其有关物质的检测。
[0206]
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。