黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及应用。


背景技术：

2.黄曲霉毒素毒性强、危害大，是污染食品种类最多的污染物，近年总体呈现污染加重趋势，严重威胁食品安全和人民健康。黄曲霉毒素是自然界毒性最强的一类真菌毒素，其中黄曲霉毒素b1是国际癌症研究组织(international agency for research on cancer,iarc)认定的i类致癌物，已引发过多起人畜群体中毒事件，成为肝癌病例高发的主要原因之一。根据近5年web of science检索数据统计：黄曲霉毒素污染食品及原料种类超过了110种，高居污染物首位。然而，迄今国内外仍没有黄曲霉毒素等微生物毒素污染前的分子预警研究范例，难以满足事前预警的迫切需求。
3.现有黄曲霉毒素预警方法主要是基于黄曲霉毒素检测技术建立，用于毒素污染水平评价或产后污染程度与消费风险评估，一旦检测发现，污染往往已经发生，难以满足事前预警与指导防控的迫切要求。利用黄曲霉毒素检测技术开展污染预警，是欧美等发达国家开展食品安全监管的成功经验。欧盟食品和饲料快速预警系统(rapid alert system for food and feed， rasff)就是利用限量标准与检测获得食品与饲料中黄曲霉毒素含量，对各国输入欧盟的食品与饲料进行快速预警。美国研究机构基于黄曲霉毒素检测技术与污染监测数据，研究建立了多元罗吉斯蒂回归分析和叠加高斯处理等预警模型，主要用于评估产后玉米等农产品真菌毒素污染程度与消费风险。
4.综合国内外近二十年研究进展，当前黄曲霉毒素早期预警分子检测技术缺乏是根本原因。针对这一瓶颈难题，发明人团队经过十多年攻关研究，成功发现了一种黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子及其早期预警作用，成为首个早期预警分子，在此基础上成功发明了黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒，并用于鉴别菌株产黄曲霉毒素能力——即产毒力，以及用于发现农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供科学依据。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术存在的不足，提供黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒及其应用，其用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品、中药材、饲料等产品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，容易推广应用。
6.为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：
7.提供黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒，包括孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的多克隆抗体、起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01纯品溶液、察氏培养基或其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养
基、与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01多克隆抗体发生结合反应的辣根过氧化物酶标记抗体、elisa显色液与终止液、样品稀释液；
8.所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子是指aft
‑
yjfz01肽，其氨基酸序列如seqid no.1所示。
9.按上述方案，所述的孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板，是通过如下方法制备获得：将上述aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体溶解在elisa包被缓冲液中，形成0.2
‑
8.0μg/ml的包被液，再加入至酶标板中(以100
‑
200μl/孔)，4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用elisa常规洗液洗涤酶标板；然后加入elisa常规封闭液(每孔加200
‑
300μl)，放置室温或37℃封闭不少于1h后，再弃去封闭液，再用elisa常规洗液洗涤酶标板。
10.所述的elisa包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液，配制方法为：称取nahco
3 1.465g、 na2co
3 0.795g,加入去离子水定容至500ml即可。
11.上述方案中，黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的多克隆抗体为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01兔源多克隆抗体，所述的辣根过氧化物酶标记抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体。
12.上述方案中，黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的多克隆抗体与黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体的动物源不同，具体可利用研究获得的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子直接用作抗原，制备获得纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体；
13.所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体，可利用aft
‑
yjfz01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可制备获得。
14.所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的兔源多克隆抗体，可利用 aft
‑
yjfz01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可制备获得。
15.所述的察氏培养基为常规察氏培养基，可以自配，也可以直接购买商品获得。
16.所述的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体可以直接购买商品获得。
17.按上述方案，所述的elisa显色液是指elisa常规的双氧水与tmb显色液。
18.所述的终止液是指elisa常规的显色终止液：2mol/l硫酸水溶液，配制方法为：取44 ml浓硫酸加入到300ml去离子水中，搅拌到冷却，最后定容至400ml即可。
19.所述的样品稀释液是指含有0.1％山梨醇和绵糖的0.01mol/l磷酸盐缓冲液，配制方法为：山梨醇与糖各0.5g、nacl 4.0g、na2hpo4·
12h2o 1.45g、kcl 0.1g、kh2po
4 0.1g，加入去离子水定容至500ml。
20.提供上述黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒的使用方法：
21.用试剂盒中的察氏培养基适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基培养并制备待鉴别菌株或待鉴别样品的待测液；
22.将待鉴别菌株的待测液用样品稀释液稀释，将稀释后待鉴别菌株的待测液或上述待鉴别样品的待测液，以每孔100
‑
200μl加入到试剂盒中的酶标板孔中，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板；
23.然后加入试剂盒中aft
‑
yjfz01多克隆抗体，每孔加入100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板；
24.然后每孔加入试剂盒中的辣根过氧化物酶标记抗体100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，
25.然后先后加入试剂盒中的elisa显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中aft
‑
yjfz01的浓度。
26.按上述方案，上述方法还包括：检测结果评判：根据酶标仪结果，获得单位体积黄曲霉待测液中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的含量，分析待鉴别菌株的黄曲霉毒素产毒力。如果待鉴别菌株中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01浓度越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强；
27.根据酶标仪结果，获得单位体积待鉴别样品液中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子 aft
‑
yjfz01的含量，判定待鉴别样品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。
28.按上述方案，用系列浓度的起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01纯品溶液(每孔100
‑
200μl)，替换待测液，用于制作标准曲线，计算得到待测样品中aft
‑
yjfz01的浓度。
29.按上述方案，上述待鉴别菌株的待测液的制备：待鉴别菌株培养，获得待鉴别菌株的待测液；具体可为：将待鉴别菌株在常规察氏培养基或者其他适宜菌株生长的培养基培养，培养的环境温度为15～35℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用无菌水稀释1
‑
10倍，获得待鉴别菌株的待测液；
30.上述待鉴别样品液的制备：待鉴别样品培养，稀释，获得待鉴别样品的待测液；
31.具体可为：称量待鉴别样品，转移至样品稀释液中，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液，取10
‑
1000μl样品均匀分散液加在含6
‑
600ml常规常规察氏培养基或者其他适宜产毒黄曲霉菌生长的培养基中，置于15
‑
35℃下200
±
50rpm震荡培养，培养6
‑
24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
32.按上述方案，上述样品为农田、农产品、中药材、饲料等产品。
33.所述试剂盒可用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力，待鉴别菌株中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强；所述试剂盒可用于鉴别农田、农产品、中药材、饲料等产品中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，待鉴别样品中如果黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子含量高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株；
34.所述的黄曲霉菌株产毒力是衡量菌株产生黄曲霉毒素能力的指标，菌株产毒力越强，表明该菌株在相同时间和培养条件下能够产生黄曲霉毒素的量越多。本发明利用研究获得的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子，结合黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体、以及兔源多克隆抗体，并由这些抗体构建成夹心免疫检测方法，并最终组装成试剂盒；试剂盒的应用中，利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子测定浓度与菌株产毒力成正相关的特征，从而用于鉴别曲霉属菌株产黄曲霉毒素能力和鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株的用途，实用且易推广用，
为及时发现黄曲霉毒素污染风险与早防早控提供了关键抓手与科学依据，对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
35.本发明有益效果在于：
36.1.提供了可用于黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测试剂盒，可用于快速定量检测黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01，2.可用于鉴别比较曲霉属黄曲霉毒素产毒菌株产黄曲霉毒素能力，3.可用于鉴别农田、农产品及饲料中是否存在强产毒力的黄曲霉毒素产毒菌株，4.易操作，实用性强，容易推广应用，5.对促进农业产业高质量发展与保障食品安全具有重要意义。
附图说明
37.图1为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测方法标准曲线。
具体实施方式
38.实施例1试剂盒中可起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的制备
39.按照如下配方配置察氏培养基：3％(w/v)蔗糖，0.3％(w/v)nano3，0.1％(w/v) k2hpo4，0.05％(w/v)mgso4
·
7h2o，0.05％(w/v)kcl，0.001％(w/v)feso4，ph6.5，配置获得察氏培养基。随机选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株hlj
‑
1、 henzy
‑
2、hubha
‑
24、jxzs
‑
29
‑
2、lnct
‑
6、gxfc
‑
34、gdzj
‑
122
‑
2、jsnt
‑
1、hundx
‑
7、 hbha
‑8‑
17等10株，分别接种到上述察氏培养基中，于28℃200rpm/min培养5天后，常规方法充分匀浆、破碎细胞，再用常规的蛋白质纯化系统、蛋白质电泳、免疫亲和等方法，即可纯化获得黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01。试验结果表明，上述产毒菌株培养物中均可以制备得到aft
‑
yjfz01，在同样培养条件下，hbha
‑8‑
17制备得到aft
‑ꢀ
yjfz01的量最多，而hlj
‑
1制备得到aft
‑
yjfz01的量最少。
40.所述的免疫亲和方法，是指用上样液稀释黄曲霉毒素产毒菌细胞破碎液，经常规滤纸过滤后，再连续加到上述免疫亲和柱中，待基本流尽时，再免疫亲和柱常规淋洗液洗涤柱体，最后用ph 2.2的甘氨酸缓冲液或者70％甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液后通过常规超滤离心方法及时去除溶液，再用无菌水从超滤离心管中溶解出留在超滤离心管内的蛋白质，即可获得黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01水溶液。
41.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的初始获得用发掘方法：
42.用于发掘黄曲霉菌株产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的方法如下：
43.(1)取黄曲霉强产毒力菌株，培养获得菌株培养物和胞外分泌蛋白质混合物；然后将菌株培养物细胞破碎，获得胞内蛋白质混合物；将上述胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物合并，加入碳二亚胺偶联获得黄曲霉抗原；
44.(2)将上述黄曲霉抗原免疫试验动物，获得纳米抗体库或单克隆抗体库；
45.(3)获得不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质合并溶液，利用步骤(2)获得的抗体库中的抗体，检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质，获得系列检测信号；
46.(4)找出检测信号与上述黄曲霉菌株产毒力呈现正相关的纳米抗体，即黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体，与黄曲霉菌株产毒力指示分子抗体对应的蛋白质即发掘出的黄曲霉菌株产毒力指示分子。
47.上述方案中，步骤(1)的黄曲霉强产毒力菌株是通过常规方法从自然界分离、鉴定，或者通过人工改造获得，其产毒力经ny/t 2311—2013标准方法鉴定结果不小于10μg/kg。
48.步骤(3)中所述的不同产毒力的黄曲霉菌株不少3株，其产毒力经ny/t 2311—2013 标准方法鉴定结果呈现为高、中、低至少3个层次。
49.所述的黄曲霉强产毒力菌株培养中采用的培养基为察氏培养基或者其他可供黄曲霉正常生长的营养物，培养时间不少于12h，培养的环境温度为15～35℃。
50.所述的菌株培养物细胞破碎是通过常规液氮研磨或者细胞破碎仪等方法。
51.所述的碳二亚胺的用量为每1.0ml合并的胞外分泌蛋白质混合物和胞内蛋白质混合物中，加入碳二亚胺量为0.005～0.1g。
52.所述的偶联反应指在15～37℃反应2～6h，在4～10℃反应过夜。
53.所述的免疫是常规免疫方式，接种黄曲霉抗原。所述的试验动物是指小白鼠或者羊驼或者其他具有相似效果的试验动物。
54.按上述方案，所述的抗体制备流程是指常规的纳米抗体制备技术流程或者常规的基于细胞融合的杂交瘤单克隆抗体制备技术流程。
55.按上述方案，所述的检测不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质是指采用常规的 westernblot技术流程，即将不同产毒力的黄曲霉菌株的蛋白质移至硝酸纤维素膜上，再利用上述抗体库中抗体，经直接方法或者间接方法检测，或者采用具有类似功效的其他技术流程。
56.按上述方案，上述直接方法是指将上述抗体库中抗体通过常规方法与信号材料偶联，再与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应。
57.按上述方案，上述间接方法是指将上述抗体库中抗体先与上述移至硝酸纤维素膜上的相应蛋白质发生免疫结合反应，然后再利用第二抗体与信号材料偶联物与上述结合到硝酸纤维素膜上的抗体发生免疫结合反应。
58.上述检测中信号材料是辣根过氧化物酶或者是胶体金或者是荧光材料或者是具有类似功效的其他材料。检测信号是显色反应信号或者是斑点信号或者是荧光信号。
59.实施例2黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体制备
60.利用aft
‑
yjfz01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
61.将上述制备获得的aft
‑
yjfz01溶解在常规pbs缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于 0.1mg/ml，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式免疫羊驼，之后每隔2
‑
4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规elisa流程监测免疫效果，至羊驼血清效价不再上升后，随后对免疫羊驼的静脉取血、提取总rna、合成cdna、vhh基因的扩增、vhh基因片段的回收、vhh基因与双酶切处理的pcantab 5e(his)载体的连接、连接产物电转化、构建纳米抗体基因库以及纳米抗体基因库的拯救等操作按照专利文献cn103866401a的方法完成，最终获得拯救后的纳米抗体基因
库。
62.将上述制备获得的aft
‑
yjfz01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96孔酶标板等固相载体上，按照专利文献cn103866401a的方法对上述拯救后的纳米抗体基因库进行2
‑
4次淘选，再用aft
‑
yjfz01和间接非竞争elisa鉴定每一噬菌体克隆产生的抗体，阳性结果对应的噬菌体为噬菌体阳性克隆，再将此阳性克隆通过纳米抗体制备的常规方式制备出纳米抗体，即为aft
‑
yjfz01的纳米抗体，用于进一步应用研究工作，优选经 elisa方法表征，具有特异性强、亲和力高的纳米抗体。
63.实施例3黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的单克隆抗体制备
64.利用aft
‑
yjfz01作为免疫抗原，采用常规方式免疫羊驼或者balb/c鼠，再利用已知常规的纳米抗体或鼠源单克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
65.将上述制备获得的aft
‑
yjfz01溶解在常规pbs缓冲液或者生理盐水中至浓度不低于 0.1mg/ml，再和弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式balb/c 鼠，之后每隔2
‑
4周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规elisa流程监测免疫效果，至balb/c鼠血清效价不再上升后，随后分离免疫小鼠脾细胞、脾细胞与鼠源骨髓瘤细胞sp2/0融合、半固体培养基对杂交瘤细胞的选择性培养操作参考专利文献cn103849604a的方法完成，待半固体培养基上长出针尖白色斑点后，将白色斑点分别挑取到内置杂交瘤常规培养基的96孔培养板，从而获得单克隆杂交瘤资源库。
66.参考专利文献cn103849604a的方法获取上述单克隆杂交瘤培养上清即单克隆抗体，将上述制备获得的aft
‑
yjfz01按8μg/孔、2μg/孔、0.5μg/孔、0.1μg/孔的梯度固定在96 孔酶标板等固相载体上，再用间接非竞争elisa程序鉴定每一单克隆抗体，挑取阳性克隆，获得aft
‑
yjfz01单克隆抗体，并用于进一步应用研究工作，优选经检测具有特异性强、亲和力高的特点的aft
‑
yjfz01单克隆抗体。
67.实施例4黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的兔源多克隆抗体制备
68.利用aft
‑
yjfz01作为免疫抗原，采用常规方式免疫新西兰大白兔等试验兔，再利用已知常规的兔多克隆抗体制备技术方案即可研制获得。
69.将上述制备获得的aft
‑
yjfz01直接用作抗原，以浓度不低于0.1mg/ml的溶液与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，通过背部皮下或皮内多点注射方式新西兰大白兔，之后每隔2
‑
4 周加强免疫1次，加强免疫时用弗氏不完全佐剂替换弗氏完全佐剂。采用常规elisa流程监测免疫效果，至免疫动物血清效价不再上升后，通过常规方法制备获得免疫动物的血清，即为黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的兔源多克隆抗体。
70.实施例5黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的免疫快速检测方法建立
71.aft
‑
yjfz01的免疫快速检测方法即双抗夹心间接非竞争elisa方法的基本操作程序：酶标板中包被aft
‑
yjfz01的纳米抗体，洗板；加入封闭液封闭，洗板；加入aft
‑
yjfz01 或待测液反应，洗板；加入aft
‑
yjfz01兔源多克隆抗体反应，洗板；加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体反应，洗板；加入显色液反应；加入终止液，酶标仪读取并计算结果。以下工作均采用该基本程序完成。
72.抗体最佳浓度的确定：采用设计棋盘滴定法同时进行多个平行实验，采用不同浓度的上述纳米抗体包被，另外将上述兔源多克隆抗体设置为不同浓度，最终根据结果确定
纳米抗体和兔源多克隆抗体的最佳工作浓度，即在节省抗体用量的原则下选择od450nm值近似1.0 的点所对应的上述两种抗体浓度，elisa结果研究表明，虽然上述纳米抗体和兔源多克隆抗体的其他浓度也可以实现检测，但是上述纳米抗体的最佳包被浓度为2.0μg/ml，上述兔源多克隆抗体的最佳浓度为3.0μg/ml。
73.最佳抗体包被条件的确定：包被是elisa方法研究的第一步，包被效果的好坏对 elisa的结果有着非常关键的影响。为确定不同包被条件对检测结果的影响，选择了4℃包被过夜、37℃恒温包被2h、37℃恒温包被1h三种不同的条件包被在孔内，检测结果表明，研究的三种包被方式均可以实现包被，4℃下包被过夜为最佳包被条件。
74.最佳封闭剂的确定：抗体完成包被以后，为了避免酶标板孔未被占用的位点对elisa 后续的步骤造成干扰，需要利用一些惰性蛋白即封闭剂来占用这些位点，而不适当的封闭剂会与二抗非特异性结合，造成假阳性的情况。本研究采用3％bsa/pbst、3％脱脂奶粉 /pbst、5％脱脂奶粉/pbst三种不同的封闭剂进行封闭，研究结果表明，虽然三种封闭剂均可不同程度的达到封闭的目的，5％脱脂奶粉/pbst的封闭效果最佳，为最佳封闭剂。
75.封闭时间的确定：研究分别设置37℃恒温封闭1h、2h、3h三种不同的封闭时长进行封闭，检测的结果表明37℃、封闭2h的设置下阳性孔od450nm值/阴性孔od450nm值的数值最大，阳性样品od450nm值＞1，因此37℃恒温封闭2h为最佳封闭时间。
76.上述兔源多克隆抗体反应时间的确定：研究分别采用37℃恒温反应30min、50min、1h 三个反应时长进行反应，检测结果表明：37℃恒温下反应50min为上述兔源多克隆抗体的最佳反应时间。
77.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的elisa标准曲线绘制：将aft
‑ꢀ
yjfz01分子分别稀释至0.00003、0.0003、0.003、0.03、0.3、3、30、300ng/ml，每孔200 μl入孔，采用上述最佳条件绘制aft
‑
yjfz01的elisa标准曲线，结果见图1。在上述最佳优化条件下建立的双抗夹心酶联免疫吸附分析方法的相关系数达0.9980，对aft
‑
yjfz01 分子检测限可达到0.1ng/ml，表明该检测方法具有良好的检测灵敏度和准确度。
78.方法特异性评价：为评价黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的上述免疫检测方法的特异性，研究选取几株与黄曲霉菌具有一定同源性的真菌尖孢镰刀菌、黑曲霉、赭曲霉菌、串珠镰刀菌等，通过对这些真菌培养物的细胞破碎液进行检测，结果见表1，上述方法对与黄曲霉菌有同源性的真菌的蛋白质均无明显的交叉反应，表明建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测方法具有良好的特异性。
79.表1.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法特异性测定结果
[0080][0081]
方法重复性评价：为评价上述建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测方法的重复性，随机取4株黄曲霉毒素的产毒菌株——阳性1、阳性2、阳性3、阳性4和1株黄曲霉毒素的不产毒菌株——阴性5研究，对测定结果的板内、板间的数据变异进行分析。上述研究结果见表2、3，经计算板内变异系数为0.5％
‑
3.5％，板间的变异
系数为0.9％
‑
5.7％，均在7％以下，因此，上述方法具有良好的重复性。
[0082]
表2.产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测方法板内重复性测定结果
[0083][0084][0085]
表3产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测方法板间重复性测定结果
[0086][0087]
方法准确度评价：为了评价上述方法的检测准确度，同时也是为了考察方法的实用性，选择花生和玉米样品为例进行研究评价，在玉米和花生样品中添加黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01，检测结果的回收率越接近100％，说明方法越准确、越实用。该研究结果见表4，结果表明，上述建立的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法用于检测花生和玉米中产毒力指示分子aft
‑
yjfz01，其回收率达到了82.5％
‑
109.5％，说明该方法准确度高，可以应用到实际样品检测中去，具有良好的实用性。
[0088]
表4.黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子免疫快速检测方法添加回收试验结果
[0089][0090][0091]
实施例6黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测试剂盒的组成与保质期
[0092]
黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测试剂盒主要由孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板、黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的兔源多克隆抗体、起标准物质作用的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01纯品溶液、察氏培养基、辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体、elisa显色液与终止液、样品稀释液共同组成。
[0093]
上述孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板的制备方法：将上述aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体溶解在elisa包被缓冲液碳酸盐溶液中，形成2μg/ml的包被液，再以100
‑
200μl/孔加入至96孔酶标板中， 4℃放置过夜或者37℃放置不少于2h后，去除上述酶标板中包被液，再用elisa常规洗液洗涤酶标板；然后每孔加200
‑
300μl的elisa常规封闭液，放置室温或37℃封闭不少于 1h后，再弃去封闭液，再用elisa常规洗液洗涤酶标板，即可获得孔底包被有黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体的酶标板。
[0094]
如上所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的纳米抗体或单克隆抗体可通过实例2和实施例3的方式制备获得。
[0095]
所述的elisa包被缓冲液是指常规碳酸盐缓冲液，配制方法为：称取nahco
3 1.465g、 na2co
3 0.795g,加入去离子水定容至500ml即可。
[0096]
所述的黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01的兔源多克隆抗体可通过实施例 4的方式制备获得。
[0097]
所述的察氏培养基为常规察氏培养基，可以自配，也可以直接购买商品获得。
[0098]
所述的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体可以直接购买商品获得。
[0099]
所述的elisa显色液是指elisa常规的双氧水与tmb显色液。
[0100]
所述的终止液是指elisa常规的显色终止液2mol/l硫酸水溶液，配制方法为：取44 ml浓硫酸加入到300ml去离子水中，搅拌到冷却，最后定容至400ml即可。
[0101]
所述的样品稀释液是指含有0.1％山梨醇和糖的0.01mol/l磷酸盐缓冲液，配制方法为：山梨醇与糖各0.5g、nacl 4.0g、na2hpo4·
12h2o 1.45g、kcl 0.1g、kh2po
4 0.1g，加入去离子水定容至500ml。
[0102]
上述试剂盒的保质期研究结果表明，4℃至少可以保存6个月以上。
[0103]
实施例7黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测试剂盒用于鉴别比较黄曲霉毒素的菌株产毒力
[0104]
第一步，待鉴别菌株的待测液的制备：按菌株产毒力强弱，选取公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》——中国农业科学院硕士学位论文，作者张杏，第33页——公布的产毒菌株hbzhx
‑
21、hbxy
‑
36、hbha
‑1‑
4、gdzj
‑
6、henzy
‑
2、 hubha
‑
24、jsnt
‑
1、hundx
‑
7、gdzj
‑
108
‑
19、hbha
‑8‑
17等10株，待鉴别菌株在上述试剂盒中的察氏培养基培养，培养的环境温度为15～35℃，培养时间不少于12h后，取培养基与培养物的混合体充分匀浆，再用上述试剂盒的样品稀释液稀释1
‑
10倍，获得待鉴别菌株的待测液。
[0105]
第二步，上述待鉴别菌株待测液的测定：上述待测液以每孔100
‑
200μl加入到上述试剂盒的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01的溶液100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中aft
‑
yjfz01兔源多克隆抗体，再每孔加入100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的elisa显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中aft
‑
yjfz01的浓度。
[0106]
根据上述文献结果，hbzhx
‑
21、hbxy
‑
36、hbha
‑1‑
4、gdzj
‑
6、henzy
‑
2、hubha
‑ꢀ
24、jsnt
‑
1、hundx
‑
7、gdzj
‑
108
‑
19、hbha
‑8‑
17等10株菌株的产毒力依次为：0μg/l、 0μg/l、3.8μg/l、4.9μg/l、67.2μg/l、81.7μg/l、192.0μg/l、204.4μg/l、297.4μg/l、 1027.5μg/l，表明hbzhx
‑
21和hbxy
‑
36为不产毒菌株，hbha
‑1‑
4和gdzj
‑
6等为弱产毒力菌株，hbha
‑8‑
17和gdzj
‑
108
‑
19等为强产毒菌株。
[0107]
第三步，鉴别结果评判：待鉴别菌株中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01 含量越高，则说明鉴别菌株产黄曲霉毒素能力即产毒力越强。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定hbzhx
‑
21、hbxy
‑
36、hbha
‑1‑
4、gdzj
‑
6、henzy
‑
2、hubha
‑
24、jsnt
‑
1、 hundx
‑
7、gdzj
‑
108
‑
19、hbha
‑8‑
17等10株菌的aft
‑
yjfz01浓度结果依次为：0ng/ml、 0ng/ml、8ng/ml、12ng/ml、49ng/ml、51ng/ml、104ng/ml、115ng/ml、175ng/ml、 536ng/ml，结果同样表明：hbzhx
‑
21和hbxy
‑
36为不产毒菌株，hbha
‑1‑
4和gdzj
‑
6 等为弱产毒力菌株，hbha
‑8‑
17和gdzj
‑
108
‑
19等为强产毒力菌株。该测定结果与上述公开文献《中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究》公布的菌株产毒力强弱次序一致，且强产毒力菌株与弱产毒力菌株鉴定结果与文献一致，证明本发明提供的试剂盒及其应用技术方案可以用于鉴别黄曲霉毒素的菌株产毒力，方法简便、易操作，实用性强。
[0108]
实施例8利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测试剂盒鉴别农田中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
[0109]
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取吉林、辽宁、江西、福建等花生花期根际土壤样品共4份，依次命名为土样
‑
1、土样
‑
2、土样
‑
3、土样
‑
4。依次称量待测的农田土壤样品，粉碎均匀后转移上述试剂盒的样品稀释液中，浓度0.5g/ml，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取50μl该待测样品均匀分散液，加到30ml的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
[0110]
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100
‑
200μl加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01的溶液100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中aft
‑
yjfz01兔源多克隆抗体，再每孔加入100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的elisa显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中aft
‑
yjfz01的浓度。
[0111]
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定土样
‑
1、土样
‑
2、土样
‑
3、土样
‑
4中aft
‑
yjfz01浓度结果依次为：0.3 ng/ml、0.2ng/ml、16ng/ml、19ng/ml。该结果表明，土样
‑
1和土样
‑
2中每毫升培养液中含有aft
‑
yjfz01的量均在1.0ng以下，不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险很低；土样
‑
1和土样
‑
2中每毫升培养液中含有aft
‑
yjfz01的量均在10 ng/ml以上，含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险较高。
[0112]
实施例9利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测试剂盒鉴别农产品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
[0113]
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取花生、玉米、大米、小麦等农产品样品共4 份，依次称量待测的农田土壤样品，粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液，浓度0.5g/ml,，室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取100μl该待测样品均匀分散液，加在含 50ml的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养6h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
[0114]
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100
‑
200μl加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01的溶液100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中aft
‑
yjfz01兔源多克隆抗体，再每孔加入100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的elisa显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中aft
‑
yjfz01的浓度。
[0115]
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒
及其应用技术方案，测定的花生、玉米、大米、小麦样品中aft
‑
yjfz01浓度结果依次为：12 ng/ml、13ng/ml、0.7ng/ml、0ng/ml。该结果表明，花生和玉米样品中每毫升培养液中含有aft
‑
yjfz01的量均在10ng以上，其含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险较高；大米样品中每毫升培养液中含有aft
‑
yjfz01的量在1.0以下，不含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险很低；测定的小麦样品中每毫升培养液中含有aft
‑
yjfz01的量为0，不含有黄曲霉毒素产毒菌株，基本无黄曲霉毒素污染风险。
[0116]
实施例10利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测试剂盒鉴别农产品中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
[0117]
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：选取人参、当归、枸杞等中药材样品共3份，依次称量待测的中药材样品，粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液，浓度0.5g/ml,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取50μl该待测样品均匀分散液，加在含30ml的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28℃下200rpm震荡培养，培养6h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
[0118]
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100
‑
200μl加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01的溶液100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中aft
‑
yjfz01兔源多克隆抗体，再每孔加入100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根过氧化物酶标记羊抗兔抗体100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的elisa显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中aft
‑
yjfz01的浓度。
[0119]
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定的人参、当归、枸杞等中药材样品中aft
‑
yjfz01浓度结果依次为： 0.3ng/ml、0ng/ml、0ng/ml。该结果表明，测定的人参样品中aft
‑
yjfz01浓度均在1.0 以下，不含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，污染风险很低；测定的当归、枸杞样品中aft
‑ꢀ
yjfz01浓度为0，不含有黄曲霉毒素产毒菌株，基本无黄曲霉毒素污染风险。
[0120]
实施例11利用黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑
yjfz01免疫快速检测试剂盒鉴别饲料中是否含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株
[0121]
第一步，待鉴别样品的待测液的制备：从市场上选取待测饲料样品共4份，依次命名为饲料
‑
1、饲料
‑
2、饲料
‑
3、饲料
‑
4。依次称量待测的农田土壤样品，粉碎后转移至上述试剂盒的样品稀释液中，浓度0.5g/ml,室温震荡至均匀，制成待测样品均匀分散液。取100μl 该待测样品均匀分散液，加在含200ml的上述试剂盒的察氏培养基中，置于28℃下 200rpm震荡培养，培养24h后取样，形成待鉴别样品的待测液。
[0122]
第二步，上述待鉴别样品待测液的测定：上述待测液以每孔100
‑
200μl加入到上述试剂盒中的酶标板孔中，或者每孔加入上述试剂盒中系列浓度的本发明产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01的溶液100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去反应后液体，洗涤酶标板，然后加入上述试剂盒中aft
‑
yjfz01兔源多克隆抗体，再每孔加入100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再液洗涤酶标板，然后每孔加入上述试剂盒中的辣根
过氧化物酶标记羊抗兔抗体100
‑
200μl，放置室温或37℃反应不少于1h后，弃去液体，再洗涤酶标板，然后先后加入上述试剂盒中的elisa显色液、终止液，最后通过酶标仪读取并计算待测样品中aft
‑
yjfz01的浓度。
[0123]
第三步，鉴别结果评判：如果待鉴别样品中黄曲霉毒素产毒菌产毒力指示分子aft
‑ꢀ
yjfz01浓度高，则说明待鉴别样品中含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株。按上述试剂盒及其应用技术方案，测定饲料
‑
1、饲料
‑
2、饲料
‑
3、饲料
‑
4中aft
‑
yjfz01浓度结果依次为：0.6 ng/ml、22ng/ml、13ng/ml、69ng/ml。该结果表明，饲料
‑
1样品中每毫升培养液中含有 aft
‑
yjfz01的量在1.0ng/ml以下，不含黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其污染风险很低；以50μl样品均匀分散液加在含30ml培养基中为例，饲料
‑
2、饲料
‑
3、饲料
‑
4中每毫升培养液中含有aft
‑
yjfz01的量均在10ng/ml以上，含有黄曲霉毒素的强产毒力菌株，其相应农田中花生产后污染风险较高。