包含2’岩藻糖基乳糖和3’半乳糖基乳糖的营养组合物的制作方法

1.本发明涉及婴幼儿配方物和改善肠道健康的领域。


背景技术：

2.人乳是优选的婴儿食品。人乳提供了数种有益于新生儿生命早期相对不成熟的免疫系统和肠道健康的生物活性因子。人乳喂养的婴儿比配方物喂养的婴儿具有更低的感染发生率。人乳中的许多组分，包括免疫球蛋白(如siga)，白介素(il)
‑
1、il
‑
6、il
‑
8、il
‑
10，干扰素
‑
γ(ifn
‑
γ)，免疫活性细胞，转化生长因子
‑
β(tgf
‑
β)，乳铁蛋白，核苷酸和人乳低聚糖(hmos)，被认为参与抵抗病原体感染的保护作用。此外，人乳喂养婴儿中的肠道成熟和微生物群发育被认为是最佳的。
3.然而，母乳喂养婴儿并不总是可行或期望的。在这种情况下，婴儿配方物或后续配方物(follow
‑
on formula)是很好的替代品。为了尽可能接近地模拟人乳的有益效果，这些配方物应具有最佳的组成。
4.wo 2005/122790公开了一种通过给予包含二十碳五烯酸(epa)、二十二碳六烯酸(dha)和花生四烯酸(ara)以及至少两种不同的低聚糖的组合物来刺激屏障完整性的方法。低聚糖通过肠道微生物群发酵成短链脂肪酸(scfa)而间接起作用。
5.wo 2016/013935公开了不可消化的低聚糖在制备用于向患有食物过敏的风险增加的婴儿提供营养的组合物中的用途。优选地，例如婴儿通过食用许多谷物而暴露于单端孢霉烯族毒素(trichothecene mycotoxin)的风险增加。在实施例中，vivinalgos是低聚半乳糖的来源。
6.wo 2010/023422公开了低聚半乳糖用于预防或治疗炎症的用途。已经测试了低聚半乳糖的混合物。
7.wo 2004/112509公开了一种用于诱导肠道屏障成熟模式类似于用母乳喂养观察到的模式的组合物。所述组合物有助于改善肠道屏障成熟，例如在新生儿应激期间。公开了大鼠中的母体分离增加了肠道的通透性，并且含有lc
‑
pufa、副干酪乳杆菌(lactobacillus paracasei)和不可消化的低聚糖的共混物可以将肠道通透性恢复至正常水平。
8.仍然需要改进用于幼儿的婴儿配方物和组合物以在结构和功能上更接近人乳。


技术实现要素：

9.发明人已经发现，营养成分2
’‑
fl和3
’‑
gl的组合对肠道屏障功能具有有益效果。还已经发现，2
’‑
fl和3
‑
gl均存在时免疫系统和微生物群的应答与这些成分中仅存在一种时不同。2
’‑
fl和3
’‑
gl的混合物已显示出对碱性磷酸酶表达具有有益效果，这表明肠道屏障功能成熟改善和抵抗肠道病原菌的防御改善。膳食丁酸(butyrate)的存在进一步改善了这些效果。因此，包含3
’‑
gl和2
’‑
fl以及优选另外的丁酸的营养组合物将对婴幼儿健康具有有益的效果。
10.实施方案列表
11.1用于婴儿或幼儿的营养组合物，其包含
12.a.2’岩藻糖基乳糖(2
’‑
fl)，和
13.b.3’半乳糖基乳糖(3
’‑
gl)。
14.2根据实施方案1所述的营养组合物，其还包含膳食丁酸。
15.3根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其中所述组合物通过产乳酸菌至少部分地发酵，并且包含0.1至1.5重量％总和的乳酸和乳酸盐，基于营养组合物的干重计，并且其中乳酸和乳酸盐总和的至少90重量％为l
‑
乳酸和l
‑
乳酸盐。
16.4根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其中所述组合物还包含选自dha、ara和epa的lc
‑
pufa，优选dha和epa，优选dha、epa和ara，更优选包含至少1重量％总和的dha、ara和epa，基于总的脂肪酸计。
17.5根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其中所述配方物还包含低聚半乳糖和/或低聚果糖。
18.6根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其中所述营养组合物选自婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物，优选婴儿配方物。
19.7根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其中所述组合物包含(i)0.01至1g 2
’‑
fl/100ml营养组合物；(ii)0.075至7.5重量％，基于干重计；和/或(iii)0.015至1.5g/100kcal。
20.8根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其中所述营养组合物包含(i)0.010至0.500g 3
’‑
gl/100ml；(ii)0.075至3.75重量％，基于干重计；和/或(iii)0.015至0.75g/100kcal。
21.9根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其包含(i)0.3至5重量％的膳食丁酸，基于总的脂肪酸计；(ii)10mg至175mg/100ml；(iii)15至250mg/100kcal；和/或(iv)0.075至1.3重量％，基于干重计。
22.10根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其包含(i)0.2至5g总和的低聚半乳糖和低聚果糖/100ml；(ii)0.3至7.5g/100kcal；和/或(iii)1.5至35重量％，基于干重计。
23.11根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其用于改善肠道屏障功能和/或用于改善免疫系统和/或用于改善肠道微生物群和/或用于治疗或预防感染，特别是肠道感染。
24.12根据前述实施方案中任一项所述的营养组合物，其用于治疗和/或预防过敏，用于诱导对过敏原的耐受性，和/或用于预防和/或治疗特应性皮炎。
25.13根据实施方案11或12所述的用于所述用途的营养组合物，其中将所述营养组合物给予婴儿或幼儿，优选婴儿。
26.14根据实施方案1
‑
10中任一项所述的营养组合物或根据实施方案11
‑
13中任一项所述的用于所述用途的营养组合物，用于向婴儿提供营养。
具体实施方式
27.本发明涉及用于婴儿或幼儿的营养组合物，其包含
28.a.2’岩藻糖基乳糖，和
29.b.3’半乳糖基乳糖。
30.在一个优选的实施方案中，营养组合物还包含膳食丁酸。
31.在另一个或进一步优选的实施方案中，营养组合物通过产乳酸菌至少部分地发酵，并且包含0.1至1.5重量％总和的乳酸和乳酸盐，基于营养组合物的干重计，并且其中乳酸和乳酸盐总和的至少90重量％为l
‑
乳酸和l
‑
乳酸盐。
32.本发明还涉及所述营养组合物，其用作药剂，优选用于治疗、预防和/或减轻疾病和/或病症。营养组合物优选用于改善肠道屏障功能，用于改善免疫系统，用于改善肠道微生物群，用于治疗或预防感染、特别是肠道感染，和/或用于治疗或预防过敏、优选用于诱导对过敏原的口服耐受性。
33.本发明的该方面还可以表述为所述营养组合物在制备用于治疗、预防和/或减轻疾病和/或病症、优选用于治疗疾病的药剂中的用途。营养组合物的用途优选为用于改善肠道屏障功能，用于改善肠道微生物群，和/或用于治疗或预防感染、特别是肠道感染。
34.本发明的该方面还可以表述为所述营养组合物用于治疗、预防和/或减轻疾病和/或病症的用途。营养组合物的用途优选为用于改善肠道屏障功能，用于改善肠道微生物群，用于治疗或预防感染、特别是肠道感染，和/或用于治疗或预防过敏、优选用于诱导对过敏原的口服耐受性。
35.本发明的该方面还可以表述为一种治疗、预防和/或减轻疾病和/或病症的方法，其包括将所述组合物给予需要其的受试者。所述方法优选用于改善肠道屏障功能，用于改善肠道微生物群，用于治疗或预防感染、特别是肠道感染，和/或用于治疗或预防过敏、优选用于诱导对过敏原的口服耐受性。
36.定义
37.在本发明的上下文中，术语“预防(prevention)”是指“降低(发生)的风险”或“降低严重程度”。术语“预防某种病症”还包括“治疗处于(增加的)所述病症风险的人”。
38.在本文及其权利要求中，动词“包含(to comprise)”及其词形变化以其非限制性意义使用，意指包括该词之后的项目，但不排除未具体提及的项目。此外，通过不定冠词“一(a)”或“一个(an)”提及要素不排除存在多于一个要素的可能性，除非上下文清楚地要求存在一个且仅一个要素。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
[0039]2’‑
岩藻糖基乳糖
[0040]
本发明的营养组合物包含2
’‑
岩藻糖基乳糖(2
‑‘
fl)。发现2
’‑
fl改善肠道屏障功能。还发现2
’‑
fl改善免疫系统。岩藻糖基乳糖(fl)是存在于人乳中的不可消化的低聚糖。它不存在于牛乳中。它由连接在一起的三个单糖单元：岩藻糖、半乳糖和葡萄糖构成。乳糖是经β1,4键连接至葡萄糖单元的半乳糖单元。岩藻糖单元经α1,2键连接至乳糖分子的半乳糖单元(2
’‑
岩藻糖基乳糖，2
’‑
fl)或经α
‑
1,3键连接至乳糖的葡萄糖单元(3
‑
岩藻糖基乳糖，3
‑
fl)。
[0041]2’‑
fl，优选α
‑
l
‑
fuc
‑
(1
→
2)
‑
β
‑
d
‑
gal
‑
(1
→
4)
‑
d
‑
glc，是市售可得的，例如购自sigma
‑
aldrich。或者，其可从人乳中分离，例如，如andersson&donald,1981,j chromatogr.211:170
‑
1744中所述，或通过遗传修饰的微生物产生，例如，如albermann等人,2001,carbohydrate res.334:97
‑
103中所述。
[0042]
优选地，本发明的营养组合物包含10mg至1g 2
’‑
fl/100ml，更优选20mg至0.5g、甚
至更优选40mg至0.2g 2
’‑
fl/100ml。基于干重计，本发明的营养组合物优选包含0.075重量％至7.5重量％2
’‑
fl，更优选0.15重量％至3.75重量％2
’‑
fl，甚至更优选0.3重量％至1.5重量％2
’‑
fl。基于能量计，本发明的营养组合物优选包含0.015至1.5g 2
’‑
fl/100kcal，更优选0.03至0.075g 2
’‑
fl/100kcal，甚至更优选0.06至0.3g2
’‑
fl/100kcal。较少量的岩藻糖基乳糖在刺激免疫系统或改善肠道屏障功能上不太有效，而过高的量将导致产品的不必要的高成本。
[0043]3’
半乳糖基乳糖
[0044]
本发明的营养组合物包含3
’‑
半乳糖基乳糖。优选地，所述3
’‑
半乳糖基乳糖为三糖gal
‑
(β1,3)
‑
gal
‑
(β1,4)
‑
glc。在本发明的上下文中，所有提及的3
‑‘
gl都是指β1,3
’‑
半乳糖基乳糖或β3
’‑
gl，除非明确指出情况并非如此。该三糖可以以合适的基质或营养组合物的形式给予。三糖可以是例如低聚半乳糖(gos)、优选β
‑
低聚半乳糖(βgos)的混合物的一部分。发现β3
’‑
gl改善肠道屏障功能。
[0045]
本发明的营养组合物优选包含0.07至3.75重量％的gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc，基于营养组合物的干重计。在一个优选的实施方案中，营养组合物包含0.07至0.375重量％的gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc，基于营养组合物的干重计。在另一个优选的实施方案中，营养组合物包含1.125至1.725重量％的gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc，基于营养组合物的干重计。
[0046]
本发明的营养组合物优选包含15至750mg gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc/100kcal营养组合物。在一个优选的实施方案中，营养组合物包含15至75mg gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc/100kcal营养组合物。在另一个优选的实施方案中，营养组合物包含225至375mg gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc/100kcal营养组合物。
[0047]
本发明的营养组合物优选包含10至500mg gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc/100ml营养组合物。在一个优选的实施方案中，营养组合物包含10至50mg gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc/100ml营养组合物。在另一个优选的实施方案中，营养组合物包含150至250mg gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc/100ml营养组合物。已知人乳含有低水平的3
’‑
gl，特别地不超过5mg/100ml。
[0048]
在一个优选的实施方案中，2
’‑
fl与3
’‑
gl的重量比范围为10:1至1:10、优选5:1至1:5、更优选3:1至1:3。
[0049]
其他低聚糖
[0050]
β1,3
’‑
半乳糖基乳糖可以是低聚半乳糖(gos)、优选β
‑
低聚半乳糖(bgos)的混合物的一部分。特别地除了β1,3
’‑
半乳糖基乳糖(β3
’‑
gl)以外，向本发明的营养组合物中添加gos也是有利的。具有不同大小和键的gos的混合物对微生物群具有增加的有益效果，并改善短链脂肪酸的产生，进而对免疫系统和/或治疗或预防感染、特别是肠道感染具有进一步改善的效果。除β3
’‑
gl以外的gos的存在特别地对大肠和小肠末端中的肠道屏障功能具有另外的效果，而β3
’‑
gl在小肠中也是——并且通常是——有效的。因此，2
’‑
fl和3
’‑
gl以及gos的组合对健康、特别是对改善肠道屏障功能、对改善免疫系统、对改善肠道微生物群和/或对治疗或预防感染、特别是肠道感染具有进一步改善的效果。
[0051]
在本发明的上下文中，形成gos的合适方式是用β
‑
半乳糖苷酶处理乳糖。取决于所使用酶的特异性，半乳糖单元由乳糖水解产生，并通过β键与另一种乳糖单元偶联以形成三
糖。还可使半乳糖单元与另一种单个半乳糖单元偶联以形成二糖。使随后的半乳糖单元偶联以形成低聚糖。大多数这样形成的低聚糖的聚合度(dp)为7以下。取决于酶，半乳糖残基之间的这些键可以主要是β1,4’、β1,6’或β1,3’。
[0052]
制备β1,6’和/或β1,4’gos的合适方法是使用来自环状芽孢杆菌(bacillus circulans)的β
‑
半乳糖苷酶。bgos的市售可得的来源是购自frieslandcampina domo(amersfoort，the netherlands)的vivinal
‑
gos。vivinal
‑
gos包括bgos，其主要具有dp 2
‑
8(峰在dp3)并且主要具有β1,4’键和β1,6’键，其中β1,4’键更主要。β1,4
’‑
半乳糖基乳糖和β1,6
’‑
半乳糖基乳糖可以由这些gos混合物富集或纯化，如本领域中已知的，例如通过尺寸排阻色谱法。主要具有β1,4’键和/或β1,6’键的bgos的其他市售可得的来源为购自yakult的oligomate 55和50，以及购自nissin sugar的cup oligo。或者，β1,4
’‑
半乳糖基乳糖和β1,6
’‑
半乳糖基乳糖可作为单组分市售获得(carbosynth)。
[0053]
制备β1,3’gos的合适方法是使用来自嗜热链球菌(s.thermophilus)的β
‑
半乳糖苷酶。特别合适的是在如fr2723960的实施例4或ep0778885的实施例6中公开的方法中使用来自菌株cncm i
‑
1470和/或cncm i
‑
1620的β
‑
半乳糖苷酶。嗜热链球菌cncm i
‑
1620由compagnie gervais danone根据布达佩斯条约于1995年8月23日保藏在collection nationale de cultures de microorganisms van institute pasteur，paris，france。菌株嗜热链球菌cncm i
‑
1620也称为菌株嗜热链球菌st065。嗜热链球菌cncm i
‑
1470由compagnie gervais danone根据布达佩斯条约于1994年8月25日保藏在collection nationale de cultures de microorganisms van institute pasteur，paris，france。这种gos的组成还更详细地记载于leforestier等人,2009eur j nutr,48:457
‑
464中。两种菌株还公开于wo 96/06924中。另一种市售可得的富含β1,3低聚半乳糖和β1,6低聚半乳糖的gos是购自clasado的bimuno，或购自gtc nutrition的purimune。β1,6
’‑
半乳糖基乳糖和β1,3
’‑
半乳糖基乳糖可由本领域已知的这些gos混合物富集或纯化，例如通过尺寸排阻色谱法。或者，纯β1,3
’‑
半乳糖基乳糖是市售可得的(carbosynth)。
[0054]
包括bgos在内的gos是不可消化的。人消化酶(包括人乳糖酶)不能使gos水解。因此，gos在被食用时完整到达大肠，并可用于肠道微生物群发酵。
[0055]
优选地，营养组合物包含至少250mg gos/100ml、更优选至少400、甚至更优选至少600mg/100ml。优选地，营养组合物包含不大于2500mg gos/100ml、优选不大于1500mg、更优选不大于1000mg。更优选地，本发明的营养组合物包含250至2500mg/100ml、甚至更优选400至1500mg/100ml、甚至更优选600至1000mg/100ml的量的gos。
[0056]
优选地，营养组合物包含基于总的组合物的干重计至少1.75重量％、更优选至少2.8重量％、甚至更优选至少4.2重量％的gos，全部基于总的组合物的干重计。优选地，营养组合物包含不大于17.5重量％、更优选不大于10.5重量％、甚至更优选不大于7重量％的gos，基于总的组合物的干重计。本发明的营养组合物优选包含1.75至17.5重量％、更优选2.8至10.5重量％、最优选4.2至7重量％的量的gos，全部基于总的组合物的干重计。
[0057]
优选地，本发明的营养组合物包含至少0.35g gos/100kcal、更优选至少0.6g、甚至更优选至少0.8g/100kcal。优选地，营养组合物包含不大于3.7g gos/100kcal、优选不大于2.5g/100kcal、更优选不大于1.5g/100kcal。更优选地，本发明的营养组合物包含0.35至3.7g/100kcal、甚至更优选0.6至2.5g/100ml、甚至更优选0.8至1.5g/100ml的量的gos。
[0058]
较少的量导致组合物不太有效，而存在较高量的gos可导致副作用，如渗透紊乱(osmotic disturbance)、腹痛、腹胀、气体形成和/或肠胃气胀。
[0059]
如本发明的营养组合物所定义的，gos的总量包括β1,3
’‑
半乳糖基乳糖的量。
[0060]
在一个优选的实施方案中，营养组合物包含0.25至2.5g低聚半乳糖/100ml，其中10mg至500mg/100ml的低聚半乳糖为gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc。在另一个优选的实施方案中，营养组合物包含0.25至2.5g低聚半乳糖/100ml，其中gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc的量大于20重量％，基于总的低聚半乳糖计。在另一个优选的实施方案中，营养组合物包含0.25至2.5g低聚半乳糖/100ml，其中gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc的量为10
‑
500mg/100ml。在另一个优选的实施方案中，营养组合物包含0.25至2.5g低聚半乳糖/100ml，其中gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc的量大于20重量％，基于总的低聚半乳糖计，并且其中gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc的量为150mg至250mg/100ml。
[0061]
在另一个优选的实施方案中，营养组合物包含0.25至2.5g低聚半乳糖/100ml，其中gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc的量为10mg至50mg/100ml。
[0062]
在该gos制剂中，β1,3
’‑
半乳糖基乳糖的量的范围优选为60
‑
65重量％，基于总的低聚半乳糖(不包括乳糖、半乳糖和葡萄糖)计。β1,3
’‑
半乳糖基乳糖的其他优选来源包括bimuno(clasado)或purimune(gtc nutrition)。
[0063]
优选地——如下文中进一步解释的——本发明的营养组合物还包含低聚果糖(fos)。
[0064]
膳食丁酸
[0065]
本发明的营养组合物优选含有膳食丁酸。发现丁酸改善肠道屏障功能。营养组合物优选包含0.3至5重量％、优选0.6至5重量％、甚至更优选1至5重量％的丁酸，基于总脂肪酰基链的重量计。本发明的营养组合物优选含有三丁酸甘油酯(即具有3个经酯键连接至丙三醇骨架的丁酸链的甘油三酯)。
[0066]
优选地，营养组合物含有0.075至1.3重量％、优选0.15至1.3重量％并且更优选0.25至1.3重量％的丁酸，基于组合物的干重计。或者，营养组合物包含0.015至0.25g丁酸/100kcal、优选0.03至0.25g丁酸/100kcal并且更优选0.05至0.25g丁酸/100kcal。当营养组合物为液体时，组合物优选含有0.01至0.175g丁酸/100ml、更优选0.02至0.175g丁酸/100ml并且更优选0.035至0.175g丁酸/100ml。已知人乳含有非常低水平的丁酸，特别地<0.1重量％，基于总的脂肪酸计。
[0067]
膳食丁酸可以由本领域已知的任何合适的来源提供。膳食丁酸的非限制性来源包括动物来源的脂肪和衍生产品，例如但不限于乳、乳脂(milk fat)、奶脂(butter fat)、乳脂肪(butter oil)、黄油、酪乳(buttermilk)、奶油乳清(butter serum)、奶油(cream)；微生物发酵衍生产品，例如但不限于酸乳和发酵酪乳；以及植物来源衍生的籽油产品，如菠萝和/或菠萝油、杏仁和/或杏仁油、大麦、燕麦、糙米、麸皮、绿豆、荚果、绿叶蔬菜、苹果、猕猴桃、橙子。在一些实施方案中，膳食丁酸是合成产生的。优选的膳食丁酸的来源是反刍动物的乳脂，优选牛乳脂。
[0068]
在膳食丁酸是合成产生的实施方案中，可以根据需要对膳食丁酸的化学结构进行修饰。此外，可以通过本领域已知的任意方式对合成产生的膳食丁酸进行纯化，以制备可掺入到本文中公开的营养组合物中的纯化的膳食丁酸添加剂。膳食丁酸可以由乳制品脂质
和/或甘油三酯结合形式的丁酸酯提供。
[0069]
在一些实施方案中，膳食丁酸可包括丁酸盐，例如丁酸钠、丁酸钾、丁酸钙、丁酸镁及其组合。在某些实施方案中，膳食丁酸包括已经用一种或多种脂肪或脂质包覆的合适的丁酸盐。在膳食丁酸包括脂肪包覆的丁酸盐的某些实施方案中，营养组合物可以是其中掺入膳食丁酸的干粉末组合物。优选地，膳食丁酸作为甘油三酯的一部分提供。这是有利的，因为当以游离形式或盐形式提供时，丁酸是挥发性的(和恶臭的)。在甘油三酯形式中，由于脂肪酶的作用而在胃中和胃后释放丁酸。
[0070]2’‑
fl、丁酸和3
’‑
gl的组合对健康、特别是对改善肠道屏障功能、对改善免疫系统、对改善肠道微生物群和/或对治疗或预防感染、特别是肠道感染具有进一步改善的效果。
[0071]
在一个优选的实施方案中，2
’‑
fl与膳食丁酸的重量比范围为10:1至1:10、优选5:1至1:5、更优选3:1至1:3。
[0072]
发酵的组合物
[0073]
本发明的营养组合物优选是至少部分发酵的。部分发酵的营养组合物至少包含部分由产乳酸菌发酵的组合物。显示部分发酵的配方物对于在暴露于生理压力或心理压力时维持肠道通透性具有保护作用。
[0074]
发酵优选在营养组合物的制备过程期间进行。优选地，营养组合物在最终产品中不含有大量的活菌，并且这可通过发酵后的热失活或通过其他方式失活来实现。优选地，发酵的组合物是乳衍生产品，其是通过产乳酸菌发酵的乳底物，其中所述乳底物包含选自以下中的至少一种：乳、乳清、乳清蛋白、乳清蛋白水解产物、酪蛋白、酪蛋白水解产物或其混合物。适当地，包含发酵的组合物和不可消化的低聚糖的营养组合物及其制备方法记载于wo 2009/151330、wo 2009/151331和wo 2013/187764中。
[0075]
发酵的组合物优选包含细菌细胞片段，如糖蛋白、糖脂、肽聚糖、脂磷壁酸(lta)、脂蛋白、核苷酸和/或荚膜多糖。直接使用包含灭活细菌和/或细胞片段的发酵组合物作为最终营养产品的一部分是有利的，因为这将导致更高浓度的细菌细胞片段。当使用产乳酸菌的市售制剂时，通常将它们洗涤，并将材料与包含细菌细胞片段的水性生长培养基分离，从而减少或消除细菌细胞片段的存在。此外，在发酵和/或产乳酸菌与乳底物的其他相互作用时，可形成另外的生物活性化合物，如短链脂肪酸、生物活性肽和/或低聚糖以及其他代谢物，其还可导致更加类似于母乳喂养婴儿的肠道微生物群功能的肠道微生物群功能。在发酵期间由产乳酸菌产生的此类生物活性化合物也可称为后生元(post
‑
biotics)。认为包含此类后生元的组合物有利地更接近母乳，因为母乳不是清洁的合成配方物，而是含有代谢物、细菌细胞、细胞片段等。因此，认为与没有产乳酸菌或仅有添加的产乳酸菌的非发酵的乳衍生产品相比，发酵组合物、特别是发酵的乳衍生产品在预防婴儿中的肠道早熟和在婴儿中诱导与在母乳喂养婴儿中观察到的肠道成熟模式更类似的肠道成熟模式方面具有改善的效果。
[0076]
优选地，基于干重计，最终的营养组合物包含5至97.5重量％、更优选10至90重量％、更优选20至80重量％、甚至更优选25至60重量％的发酵组合物。可以采用最终的营养组合物中乳酸和乳酸盐总和的水平作为指定最终的营养组合物包含至少部分发酵的组合物和指定发酵程度的方式，因为这是产乳酸菌在发酵时产生的代谢终产物。本发明的最终
营养组合物优选包含0.1至1.5重量％总和的乳酸和乳酸盐、更优选0.15至1.0重量％、甚至更优选0.2至0.5重量％，基于组合物的干重计。或者，营养组合物包含0.02至0.3g总和的乳酸和乳酸盐/100kcal、优选0.03至0.2总和的乳酸和乳酸盐/100kcal、优选0.04至0.1总和的乳酸和乳酸盐/100kcal。或者，当组合物为液体时，乳酸和乳酸盐的总和为0.0125至0.2g/100ml、优选0.02至0.125g/100ml、优选0.03至0.07g/100ml。
[0077]
优选地，乳酸和乳酸盐总和的至少50重量％、甚至更优选至少90重量％为l( )
‑
异构体的形式。因此，在一个实施方案中，l( )
‑
乳酸和l( )
‑
乳酸盐的总和大于50重量％、更优选大于90重量％，基于总的乳酸和乳酸盐之和计。本文中，l( )
‑
乳酸盐和l( )
‑
乳酸也称为l
‑
乳酸盐和l
‑
乳酸。
[0078]2’‑
fl、3
’‑
gl和任选的丁酸，以及部分发酵的配方物的组合对健康、特别是对改善肠道屏障功能、对改善免疫系统、对改善肠道微生物群和/或对治疗或预防感染、特别是肠道感染具有进一步改善的效果。
[0079]
lcpufa
[0080]
本发明的营养组合物优选包含长链多不饱和脂肪酸(lc
‑
pufa)。lc
‑
pufa是具有20至24个碳原子、优选20或22个碳原子长度的脂肪酸或脂肪酰基链，其包含两个或更多个不饱和键。优选地，营养组合物包含至少一种、优选两种、更优选三种选自二十二碳六烯酸(dha)、二十碳五烯酸(epa)和花生四烯酸(ara)的lc
‑
pufa。发现这些lc
‑
pufa改善肠道屏障功能，并因此可以特别有利地与2
‑‘
fl，和3
’‑
gl以及任选的丁酸组合以进一步改善肠道屏障。该组合具有预料不到的有益效果，并且优选协同地起作用。优选地，营养组合物包含升高量的此类lc
‑
pufa。当前的婴儿配方物，在它们包含这些lc
‑
pufa的情况下，通常具有0.4至0.9重量％的量的总和dha、ara和epa，基于总的脂肪酸计。在本发明的营养组合物中，这些lc
‑
pufa的量优选大于1重量％、优选大于1.1重量％，基于总的脂肪酸计。优选地，这些lc
‑
pufa的量基于总的脂肪酸计不大于15重量％、优选不大于5重量％、优选基于总的脂肪酸计不大于2.5重量％。进一步优选这些lc
‑
pufa的量的范围为1
‑
15重量％、优选1.1
‑
5重量％、更优选1.5
‑
2.5重量％，基于总的脂肪酸计。这被认为是婴儿配方物中用于改善肠道屏障功能的最佳范围。
[0081]
优选地，dha的量为至少0.4、优选至少0.5重量％，基于总的脂肪酸计。优选地，dha的量不大于1重量％、优选不大于0.7重量％，基于总的脂肪酸计。优选地，营养组合物包含至少0.5重量％、优选至少0.7重量％、更优选至少1重量％的量的dha，基于总的脂肪酸计。优选地，营养组合物包含0.4至1重量％、更优选0.5至0.7重量％的量的dha。
[0082]
优选地，营养组合物包含至少0.09重量％、优选至少0.1重量％并且优选不大于0.4重量％、更优选不大于0.1重量％的量的epa，基于总的脂肪酸计。优选地，营养组合物包含0.09至0.4重量％、更优选0.1至0.2重量％的量的epa。
[0083]
优选地，营养组合物包含至少0.25重量％、更优选至少0.5重量％且优选不大于1重量％的量的ara，基于总的脂肪酸计。优选地，营养组合物包含0.4至1重量％、更优选0.5至0.7重量％的量的ara。
[0084]
优选地，营养组合物包含基于总的脂肪酸计0.4至1.0重量％的量的dha，和基于总的脂肪酸计0.09至0.4重量％的量的epa。更优选地，营养组合物包含基于总的脂肪酸计0.5至0.7重量％的量的dha，和基于总的脂肪酸计0.1至0.2重量％的量的epa。特别优选营养组
合物包含基于总的脂肪酸计大于0.5重量％的量的dha，和基于总的脂肪酸计大于0.1重量％的量的epa。优选地，营养组合物分别包含基于总的脂肪酸计0.4至1.0重量％、0.09至0.4重量％和0.25至1.0重量％的量的dha、epa和ara。更优选地，营养组合物分别包含基于总的脂肪酸计0.5至0.7重量％、0.1至0.2重量％和0.5至0.7重量％的量的dha、epa和ara。
[0085]
优选地，营养组合物包含20至50mg/100kcal的量的dha和4.3至10.8mg/100kcal的量的epa。更优选地，营养组合物包含25至33.5mg/100kcal的量的dha和5.4至7.2mg/100kcal的量的epa。最优选地，营养组合物包含约25mg/100kcal的量的dha和约5.4mg/100kcal的量的epa。在这些实施方案中，任选地存在ara。如果存在，则ara的量优选为12.5至50mg、更优选25至33.5mg且最优选约25mg/100kcal。优选地，dha/ara的重量比为0.9至2。
[0086]
优选地，dha/epa/ara的重量比为1:(0.19
‑
0.7):(0.9
‑
2.0)。dha、epa和ara的这样的量和/或比例对于进一步改善肠道屏障功能、进一步改善肠道微生物群和/或治疗或预防感染、特别是肠道感染是最佳的。lc
‑
pufa可以作为游离酸、以甘油三酯形式、以甘油二酯形式、以甘油单酯形式、以磷脂形式或作为以上一种或多种的混合物提供。这些lc
‑
pufa的合适的来源为例如鱼油和来自高山被孢霉(mortierella alpina)的油。
[0087]
优选地，本发明的营养组合物包含脂质，其中所述脂质包含选自dha、epa和ara的lc
‑
pufa，并且其中dha、epa和ara的总和基于总的脂肪酸计为至少1重量％，并且其中所述脂质包含基于总的脂肪酸计0.4至1.0重量％的量的dha、基于总的脂肪酸计0.09至0.4重量％的量的epa和基于总的脂肪酸计0.25至1重量％的量的ara。在该实施方案中，进一步优选脂质包含基于总的脂肪酸计0.5至0.7重量％的量的dha、基于总的脂肪酸计0.1至0.2重量％的量的epa和基于总的脂肪酸计0.5至0.7重量％的量的ara。更优选地，脂质包含至少0.5重量％的量的dha、至少0.1重量％的量的epa和至少0.5重量％的量的ara，全部基于总的脂肪酸计。
[0088]2’‑
fl、3
’‑
gl和任选的丁酸，以及lc
‑
pufa、特别是epa、dha和/或ara的组合对健康、特别是对改善肠道屏障功能、对改善免疫系统、对改善肠道微生物群和/或对治疗或预防感染、特别是肠道感染具有进一步改善的效果。
[0089]
营养组合物
[0090]
本发明的营养组合物不是人乳。
[0091]
本发明的营养组合物用于婴儿或幼儿。
[0092]
本发明的营养组合物优选包含脂质、蛋白质和碳水化合物，并且优选以液体形式给予。本发明的营养组合物还可以是干食品的形式、优选为粉末形式，其附有关于将所述干食品、优选粉末与合适的液体、优选水进行混合的说明书。因此，本发明的营养组合物可以是粉末的形式，适于用水复原(reconstitute)以提供即饮型营养组合物，优选即饮型婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物，更优选即饮型婴儿配方物或后续配方物。本发明的营养组合物优选包含其他级分，如维生素、矿物质、痕量元素和其他微量营养素，以使其成为完整的营养组合物。优选地，根据国际指令，婴儿配方物和后续配方物包含维生素、矿物质、痕量元素和其他微量营养素。
[0093]
本发明的营养组合物优选包含脂质、蛋白质和可消化的碳水化合物，其中脂质提供总热量的25至65％，蛋白质提供总热量的6.5至16％，以及可消化的碳水化合物提供总热量的20至80％。优选地，在本发明的营养组合物中，脂质提供总热量的30至55％，蛋白质提
供总热量的7至9％，以及可消化的碳水化合物提供总热量的35至60％。为计算蛋白质的总热量％，需要考虑由蛋白质、肽和氨基酸提供的能量总和。
[0094]
优选地，脂质提供3至7g脂质/100kcal、优选3.5至6g/100kcal，蛋白质提供1.6至4g/100kcal、优选1.7至2.3g/100kcal，以及可消化的碳水化合物提供5至20g/100kcal、优选8至15g/100kcal的营养组合物。优选地，本发明的营养组合物包含提供3.5至6g/100kcal的脂质、提供1.7至2.3g/100kcal的蛋白质和提供8至15g/100kcal营养组合物的可消化的碳水化合物。
[0095]
优选地，脂质提供2.5至6.5g脂质/100ml、优选2.5至4g/100ml，蛋白质提供1至3g/100ml、优选1至1.5g/100ml，以及可消化的碳水化合物提供3至13g/100ml、优选5至10g/100ml的营养组合物。优选地，本发明的营养组合物包含提供2.0至6.5g/100ml的脂质、提供1至3g/100ml的蛋白质和提供5至10g/100ml营养组合物的可消化的碳水化合物。
[0096]
优选地，基于组合物的干重计，脂质占15至45重量％、优选20至30重量％；基于组合物的干重计，蛋白质占8至20重量％、优选8.5至11.5重量％；基于组合物的干重计，可消化的碳水化合物占25至90重量％、优选40至75重量％。优选地，本发明的营养组合物包含占20至30重量％的脂质、占8.5至11.5重量％的蛋白质和占40至75重量％的可消化的碳水化合物，全部基于组合物的干重计。
[0097]
本发明的组合物优选包含脂质。优选地，本发明的组合物包含至少一种选自植物脂质的脂质。优选地，本发明的组合物包含植物脂质和至少一种选自鱼油、藻油、真菌油和细菌油的油的组合。本发明营养组合物的脂质优选提供3至7g/100kcal营养组合物，优选脂质提供3.5至6g/100kcal。当为液体形式例如作为即食型液体时，营养组合物优选包含2.0至6.5g脂质/100ml、更优选2.5至4.0g/100ml。基于干重计，本发明的营养组合物优选包含15至45重量％、更优选20至30重量％的脂质。优选地，本发明的营养组合物包含至少一种、优选至少两种选自以下的脂质来源：油菜籽油(如菜籽油(colza oil)、低芥酸油菜籽油和加拿大油菜(canola)油)、高油酸向日葵油、高油酸红花油、橄榄油、苦参素油(marine oil)、微生物油、椰子油、棕榈仁油。
[0098]
本发明的营养组合物优选包含蛋白质。用于营养组合物中的蛋白质优选选自非人类动物蛋白质，优选乳蛋白、植物蛋白，例如优选大豆蛋白和/或大米蛋白，及其混合物。本发明的营养组合物优选含有酪蛋白和/或乳清蛋白，更优选牛乳清蛋白和/或牛酪蛋白。因此，在一个实施方案中，本发明营养组合物中的蛋白质包含选自乳清蛋白和酪蛋白的蛋白，优选乳清蛋白和酪蛋白，优选乳清蛋白和/或酪蛋白来自牛乳。优选地，基于总的蛋白计，蛋白质包含小于5重量％的游离氨基酸、二肽、三肽或水解蛋白。本发明的营养组合物优选包含酪蛋白和乳清蛋白，酪蛋白：乳清蛋白的重量比为10:90至90:10、更优选20:80至80:20、甚至更优选35:65至55:45。
[0099]
在一个实施方案中，用于营养组合物中的蛋白质包含水解蛋白，优选用于营养组合物中的蛋白质为水解蛋白或换句话说由水解蛋白组成。水解蛋白还可包含游离氨基酸。优选地，水解蛋白包含水解的乳清蛋白。在一个实施方案中，用于营养组合物中的蛋白质为游离氨基酸或换句话说由游离氨基酸组成。因此，在一个优选的实施方案中，本发明的营养组合物包含2
’‑
fl和膳食丁酸以及任选地3’gl，还包含水解蛋白和/或游离氨基酸。这样的组合物优选用于预防或治疗过敏、更优选用于预防或治疗牛乳蛋白过敏。
[0100]
基于本发明营养组合物的干重计，重量％蛋白质是根据凯氏定氮法(kjeldahl
‑
method)通过测量总氮并且在酪蛋白的情况下使用6.38的转换因子或对于除酪蛋白以外的其他蛋白使用6.25的转换因子进行计算的。本发明中使用的术语“蛋白质”或“蛋白质组分”是指蛋白质、肽和游离氨基酸的总和。
[0101]
本发明的营养组合物优选包含提供1.6至4.0g蛋白质/100kcal营养组合物、优选提供11.7至2.3g/100kcal营养组合物的蛋白质。基于总热量计，过低的蛋白质含量会导致婴儿和幼儿的生长和发育不足。过高的量会给例如婴儿和幼儿的肾脏带来代谢负担。当为液体形式时，作为即食型液体，营养组合物优选包含1.0至3.0g、更优选1.0至1.5g蛋白质/100ml。基于干重计，本发明的营养组合物优选包含8至20重量％、更优选8.5至11.5重量％的蛋白质，基于总的营养组合物的干重计。
[0102]
本发明的营养组合物优选包含提供5至20g/100kcal、优选8至15g/100kcal的可消化的碳水化合物。优选地，在本发明的营养组合物中，可消化的碳水化合物的量为25至90重量％、更优选8.5至11.5重量％，基于组合物的总干重计。优选的可消化的碳水化合物为乳糖、葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、淀粉和麦芽糖糊精。乳糖是人乳中存在的主要的可消化的碳水化合物。本发明的营养组合物优选包含乳糖。优选地，本发明的营养组合物不包含除乳糖以外的大量的碳水化合物。与可消化的碳水化合物如麦芽糖糊精、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和具有高血糖指数的其他可消化的碳水化合物相比，乳糖具有较低的血糖指数，因此是优选的。本发明的营养组合物优选包含可消化的碳水化合物，其中至少35重量％、更优选至少50重量％、更优选至少60重量％、更优选至少75重量％、甚至更优选至少90重量％、最优选至少95重量％的可消化的碳水化合物为乳糖。基于干重计，本发明的营养组合物优选包含至少25重量％的乳糖、优选至少40重量％、更优选至少50重量％的乳糖。
[0103]
本发明的营养组合物优选包含不可消化的低聚糖(ndo)。本文中使用的术语“低聚糖”是指聚合度(dp)为2至250、优选dp为2至100、更优选2至60、甚至更优选2至10的糖。如果本发明的营养组合物中包含dp为2至100的低聚糖，则这会导致组合物可含有dp为2至5、dp为50至70和/或dp为7至60的低聚糖。本发明中使用的术语“不可消化的低聚糖”(ndo)是指在肠中不会通过人的上消化道例如小肠和胃中存在的酸或消化酶的作用而消化的低聚糖，但其优选通过人肠道微生物群发酵。例如，蔗糖、乳糖、麦芽糖和麦芽糖糊精被认为是可消化的。
[0104]
优选地，本发明的不可消化的低聚糖是可溶的。当提及多糖、纤维或低聚糖时，本文中使用的术语“可溶的”是指根据l.prosky等人,j.assoc.off.anal.chem.71,1017
‑
1023(1988)记载的方法，所述物质至少是可溶的。
[0105]
β1,3
’‑
半乳糖基乳糖可以本身的形式或作为低聚半乳糖(gos)、优选β
‑
低聚半乳糖(bgos)的混合物的一部分存在于本发明的营养组合物中。在一个优选的实施方案中，β1,3
’‑
半乳糖基乳糖作为低聚半乳糖的混合物的一部分存在。在一个实施方案中，gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc的量大于20重量％，基于总的低聚半乳糖计。
[0106]
优选地，本发明的营养组合物还包含低聚果糖(fos)。本发明中使用的术语“低聚果糖”是指基于单体亚基计由大于50％、优选大于65％的果糖单元组成的碳水化合物，其中至少50％、更优选至少75％、甚至更优选至少90％的果糖单元通过β
‑
糖苷键、优选β
‑
2,1糖苷键连接在一起。葡萄糖单元可存在于果糖单元链的还原端。优选地，低聚果糖的dp或平均
dp在2至250、更优选2至100、甚至更优选10至60范围内。术语“低聚果糖”包括左聚糖、水解左聚糖、菊粉、水解菊粉和合成的低聚果糖。优选地，制剂包含平均聚合度(dp)为3至6的短链低聚果糖，更优选水解菊粉或合成的低聚果糖。优选地，制剂包含平均dp大于20的长链低聚果糖。优选地，制剂同时包含短链低聚果糖和长链低聚果糖。适合用于本发明组合物中的低聚果糖也易于市售获得，例如raftilinehp(orafti)。优选地，本发明的营养组合物包含至少25mg fos/100ml、更优选至少40、甚至更优选至少60mg。优选地，组合物包含不大于250mg fos/100ml、更优选不大于150mg/100ml并且最优选不大于100mg/100ml。fos的量优选为25至250g低聚果糖/100ml、优选40至150g/100ml、更优选60至100g/100ml。优选地，基于干重计，本发明的营养组合物包含至少0.15重量％的fos、更优选至少0.25重量％、甚至更优选至少0.4重量％。优选地，基于总的组合物的干重计，组合物包含不大于1.5重量％的fos、更优选不大于2重量％。fos的存在对微生物群及其scfa产生显示出进一步改善的效果。
[0107]
优选地，本发明的营养组合物包含低聚半乳糖(包括β1,3
’‑
半乳糖基乳糖)和低聚果糖的混合物。优选地，低聚半乳糖和低聚果糖的混合物以1/99至99/1、更优选1/19至19/1、更优选1/1至19/1、更优选2/1至15/1、更优选5/1至12/1、甚至更优选8/1至10/1的重量比、甚至更优选以约9/1的比例存在。在低聚半乳糖具有低的平均dp并且低聚果糖具有相对高的dp时，该重量比是特别有利的。最优选平均dp低于10、优选低于6的低聚半乳糖和平均dp高于7、优选高于11、甚至更优选高于20的低聚果糖的混合物。
[0108]
在一个优选的实施方案中，本发明的营养组合物包含短链(sc)低聚果糖和长链(lc)低聚果糖的混合物。优选地，短链低聚果糖和长链低聚果糖的混合物以1/99至99/1、更优选1/19至19/1、甚至更优选1/10至19/1、更优选1/5至15/1、更优选1/1至10/1的重量比存在。优选平均dp低于10、优选低于6的短链低聚果糖和平均dp高于7、优选高于11、甚至更优选高于20的低聚果糖的混合物。
[0109]
在另一个优选的实施方案中，本发明的营养组合物包含短链(sc)低聚果糖和短链(sc)低聚半乳糖的混合物。优选地，短链低聚果糖和短链低聚半乳糖的混合物以1/99至99/1、更优选1/19至19/1、甚至更优选1/10至19/1、更优选1/5至15/1、更优选1/1至10/1的重量比存在。优选短链低聚果糖和平均dp低于10、优选低于6的短链低聚半乳糖的混合物。
[0110]
本发明的营养组合物优选包含1.75至17.5重量％的总的不可消化的低聚糖、更优选2.8至10.5重量％、最优选4.2至7重量％，基于营养组合物的干重计。基于100ml计，本发明的营养组合物优选包含0.25至2.5g的总的不可消化的低聚糖、更优选0.4至1.5g、最优选0.6至1g，基于100ml的营养组合物计。较低量的不可消化的低聚糖在改善肠道屏障功能上不太有效，而过高的量会导致腹胀和腹部不适的副作用。不可消化的低聚糖的总量包括低聚半乳糖(包括β3
’‑
gl)、低聚果糖和可进一步存在于组合物中的任何其他不可消化的低聚糖。
[0111]
同样重要的是，本发明的营养组合物不具有过量的热量密度，然而仍然提供足够的热量来喂养受试者。因此，液体食品优选具有0.1至2.5kcal/ml的热量密度、更优选0.5至1.5kcal/ml的热量密度、甚至更优选0.6至0.8kcal/ml并且最优选0.65至0.7kcal/ml。
[0112]
应用
[0113]
本发明的营养组合物优选为婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物。幼儿配方物
的实例为幼童乳(toddler milk)、幼童配方物和成长乳。更优选地，营养组合物为婴儿配方物或后续配方物。本发明的营养组合物可有利地用作婴儿的完全营养。婴儿配方物定义为用于婴儿的配方物，并且可以是例如旨在用于0至6月龄或0至4月龄婴儿的起始配方物。后续配方物旨在用于4或6月龄至12月龄的婴儿。在该年龄段，婴儿开始断奶吃其他食物。幼儿配方物或幼童或成长的乳或配方物旨在用于12至36月龄的儿童。优选地，本发明的营养组合物是婴儿配方物。
[0114]
婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物可以为液体形式、优选即饮型液体，或为粉末形式。在一个实施方案中，婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物为粉末形式，适于用水复原以提供即饮型婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物。应当理解，当本发明的婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物为粉末形式时，所述配方物中包括不可消化的低聚糖、2
’‑
fl和3
’‑
gl在内的所有成分的量定义为在用水使粉末复原后存在的量，即所述量定义为以mg/100ml即饮型配方物计。
[0115]
本发明的营养组合物用于为婴儿或幼儿、优选婴儿、优选最高达12个月龄的婴儿提供营养。
[0116]
本发明的婴儿配方物、后续配方物或幼儿配方物用于为婴儿或幼儿、优选婴儿、优选最高达12个月龄的婴儿提供营养。
[0117]
上文描述的用于本发明的婴儿配方物、后续配方物和幼儿配方物的优选的实施方案还适用于本发明使用的婴儿配方物、使用的后续配方物和使用的幼儿配方物。
[0118]
本发明还涉及包含2
‑‘
fl、丁酸和任选地3
‑‘
gl的组合物或本发明的组合物用作药剂。优选地，所述组合物用于改善婴儿的肠道健康、特别是肠道屏障功能和肠道成熟，用于改善肠道生理，用于改善肠道屏障功能，用于改善肠道微生物群、特别是用于减少肠道病原菌，用于治疗或预防感染、特别是肠道感染和/或用于治疗和/或预防过敏，和/或用于诱导对过敏原的口服耐受性。
[0119]
优选地，所述组合物用于改善免疫系统，优选用于减少th2应答。
[0120]
由于本发明的营养组合物对肠道屏障功能具有改善的效果，因此它会减少过敏原、毒素和/或病原体的移位，从而预防和/或治疗过敏和/或预防或治疗感染。由于还发现了对肠道碱性磷酸酶活性具有改善的效果，因此营养组合物减少肠道病原体，从而预防和/或治疗感染、特别是肠道感染。乳糖酶成熟和肠道细胞增殖的改善进一步表明了改善的肠道屏障成熟。观察到微生物群改善、双歧杆菌增加、发酵酸化增强和病原体减少。此外，肠道微生物群和/或免疫系统的改善有益地预防和/或治疗过敏和感染、特别是肠道感染。对免疫系统的作用会对诱导对过敏原的口服耐受性产生效果。
[0121]
关于il
‑
10以及ccl20水平的效果均表明在2
’‑
fl和丁酸的组合的存在下，人pbmc应答得到预料不到的改善的调节，当存在3
’‑
gl时，甚至得到了进一步改善。
[0122]
由于本发明的营养组合物对降低th2应答具有改善的效果，因此其能预防和/或治疗过敏。
[0123]
本发明的营养组合物优选用于为患有过敏或具有增加的患有过敏风险的婴儿或幼儿、优选婴儿提供营养。
[0124]
本发明还涉及本发明的营养组合物用于向婴儿或幼儿提供营养、优选用于向婴儿提供营养的用途。
[0125]
附图简述
[0126]
图1：
[0127]
不同的半乳糖基乳糖(gl)对don诱导的caco
‑
2细胞单层完整性损害的影响。图1a和1b显示了不同gl的跨上皮电阻(teer)。图1c和1d显示了荧光黄(lyf)向基底外侧区室的移位。teer表示为初始值的百分比，lyf以ng/cm
2 x h即以ng/ml表示。α3
’‑
gl为gal(α1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc；β3
’‑
gl为gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc；β4
’‑
gl为gal(β1
‑
4)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc’；β6
’‑
gl为gal(β1
‑
6)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc。数据为平均值
±
s.e。*：与对照相比，p<0.05；**：与对照相比，p<0.01；*＊*：与对照相比，p<0.001；^：与don对照相比，p<0.05；^^：与don对照相比，p<0.01；^^^：与don对照相比，p<0.001。
[0128]
图2：
[0129]
gl对don诱导的caco
‑
2细胞的il8释放增加的不同影响。il
‑
8分泌表示为pg/ml，为平均值
±
s.e。α3
’‑
gl为gal(α1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc；β3
’‑
gl为gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc；β4
’‑
gl为gal(β1
‑
4)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc；β6
’‑
gl为gal(β1
‑
6)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc。数据为平均值
±
s.e。*：与对照相比，p<0.05；**：与对照相比，p<0.01；*＊*：与对照相比，p<0.001；^：与don对照相比，p<0.05；^^：与don对照相比，p<0.01；^^^：与don对照相比，p<0.001。
[0130]
实施例
[0131]
实施例1：具有2
’‑
fl和膳食丁酸的婴儿配方物改善肠道碱性磷酸酶表达
[0132]
对两种婴儿配方物进行体外消化步骤，并且在体外消化步骤后，检查对肠道屏障成熟、特别是碱性磷酸酶(ap)成熟的影响。ap是通过肠上皮细胞表达和分泌并用作分化标记物的肠道酶。ap通过使有害物质如微生物配体脂多糖(内毒素)去磷酸化而在肠道稳态和先天免疫防御中起关键作用。
[0133]
对照婴儿配方物是非发酵的婴儿配方物，当为即饮型形式时，补充有0.8mg/100ml的量的不可消化的低聚糖(scgos/lcfos)。scgos来源于vivinal gos，lcfos来源于raftilinehp。脂肪组分主要为植物油、鱼油和微生物油(花生四烯酸的来源)。丁酸的量低于0.05重量％，基于总的脂肪计。
[0134]
活性婴儿配方物为类似于实施例8的部分发酵的婴儿配方物，即另外含有0.1g 2
’‑
fl，脂质组分包含约50重量％的牛乳脂，并且具有基于总的脂肪酸计约1.5重量％的丁酸、约3.4g脂肪/100ml、基于干重计约0.28重量％的乳酸和当为即饮型形式时约25mg 3
’‑
gl/100ml。
[0135]
体外消化：
[0136]
在miliq水中以13.7％(w/v)制备婴儿配方物，并将35ml转移到模拟婴儿条件的计算机控制的半动态胃肠模型的生物反应器中。每个反应器配备有ph电极和四个配料管线。每个配料管线都连接一个添加以下物质的泵：a)盐酸，0.25m；和b)碳酸氢钠，0.5m，用于ph控制；或c)模拟胃液(sgf)；d)模拟肠液(sif)。通过以下方法来控制ph：在消化开始时将ph标准化为6.8，然后在2小时的胃阶段期间逐渐将ph降至4.3。在肠消化阶段，在2小时内逐渐将ph从6.5升至7.2。在t＝0(消化开始)时，加入5.8ml的模拟唾液(100mm nacl，30mm kcl，1.4mm cacl2，14mm nahco3，0.6mg/ml来自米曲霉(aspergillus oryzae)的α
‑
淀粉酶(sigma，a9857))作为推注(bolus)。从t＝0开始，逐渐加入12.25ml的sgf(100mm nacl，30mm kcl，1.4mm cacl2，50mm乙酸钠，0.125mg/ml来自猪胃粘膜的胃蛋白酶(sigma，p7012)和
0.05mg/ml来自米根霉(rhizopus oryzae，amano)的脂肪酶)直至t＝120(胃阶段结束)。将ph增加至6.5，开始连续的肠阶段，并逐渐添加31.5ml sif(100mm nacl，10mm kcl，1.7mm cacl2，0.17mg/ml来自牛胰腺的胰蛋白酶(sigma，t9201)，0.18mg/ml来自牛胰腺的胰凝乳蛋白酶(sigma，c4129)，0.09mg/ml来自猪胰腺的胰脂酶(sigma，l0382)，1.42mg/ml牛磺胆酸盐(taurocholate)(sigma，86339)和0.6mg/ml牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholate)(sigma，t0266))。在模拟胃肠消化结束时，取5ml样品，与5ml酶抑制剂缓冲液(0.1m磷酸钠，ph 5.5，0.58mg/ml来自大豆(glycine max)的胰蛋白酶
‑
胰凝乳蛋白酶抑制剂(sigma，t9777)，34.5μg/ml的奥利司他(orlistat)(sigma，o4139))混合，速冻，并在
‑
20℃下储存，直至进一步使用。
[0137]
细胞分化
[0138]
将来自肠上皮细胞状和刷状缘的表达人肠细胞系c2bbe1(crl
‑
2102
tm
)的细胞以5000细胞/孔接种在96孔的nunc
tm
edge板中，并在具有10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素和0.01mg/ml人转铁蛋白的dulbecco改良的eagle培养基(目录号30
‑
2002)中生长至融合。在达到融合后，将培养基替换为在不含胎牛血清的培养基中稀释的预消化的婴儿配方物，最终浓度为0.34％、0.17％和0.085％(w/v)，一式四份，并在37℃、5％co2下培育96小时，在48小时后用稀释的预消化的婴儿配方物恢复。在培育期结束时，每孔收集50μl培养基，将四份合并，并在
‑
20℃下储存，直至测量ap活性。然后，将所有的孔用冰冷的磷酸盐缓冲盐水洗涤，并向每个孔中加入ph为7.0的100μl 50mm的tris
‑
hcl、150mm的nacl、0.5％的triton
‑
100。在冰上培育30分钟后，收集细胞裂解物，并根据制造商的说明书使用thermo fischer，pierce bca蛋白质分析试剂盒测定蛋白质含量。根据制造商的说明书，通过biovision碱性磷酸酶活性比色分析试剂盒(biovision alkaline phosphatase activity colorimetric assay kit)测定ap活性。ap活性表示为单位/mg蛋白质。
[0139]
结果
[0140]
当与使用预消化的对照配方物处理的肠上皮细胞相比时，使用本发明的预消化的婴儿配方物处理的肠上皮细胞中的ap活性在统计学上显著增加(p<0.05，t检验)。该效果是剂量依赖性的，并且在所有的测试浓度下显著不同。与对照配方物相比，在0.34％、0.17％和0.085％(w/v)的婴儿配方物浓度下，细胞外ap活性增加分别为43％、36％和32％，参见表1。细胞外ap活性的这种增加表明肠道屏障功能成熟改善和抵抗肠道病原菌的防御改善。
[0141]
表1：暴露于预消化的对照配方物或实验配方物的肠道肠上皮细胞的ap活性，以mu/mg蛋白计。
[0142]
稀释(x)if浓度(g/100ml)对照配方物 测试配方物
ꢀꢀꢀꢀ
平均sem平均semp*400.340.844850.089921.208024.601e
‑
020.023800.171.160730.053461.575696.284e
‑
020.0071600.0851.492910.114941.962745736e
‑
020.022
[0143]
*p值通过t
‑
检验、2尾、双样本等方差确定。
[0144]
实施例2：具有2
’‑
fl和3
’‑
gl的婴儿配方物改善肠道乳糖酶的表达和细胞增殖
[0145]
在与实施例1类似的实验中测试实施例1的营养组合物。使用13.6％(w/v)的配方物代替13.7的配方物。在胃阶段中使用16.6mg/ml的兔脂肪酶(germ，reg.340)代替来自米
根霉的脂肪酶。在肠阶段，使用0.06mg/ml来自猪胰腺的胰脂酶(sigma，l0382)和3.5mg/ml猪胰脂酶(sigma l0126)代替0.09mg/ml来自猪胰腺的胰脂酶(sigma，l0382)。
[0146]
通过将30μl细胞裂解物与30μl分析缓冲液(马来酸0.625m，乳糖0.12m，ph 6.0)混合并在37℃下培育4小时来测量乳糖酶活性，对所得葡萄糖进行定量。乳糖酶活性表示为μmol葡萄糖/分钟/mg。
[0147]
发现与预消化的对照配方物相比，当用预消化的实验测试婴儿配方物处理细胞时，乳糖酶活性显著增加，参见表2。
[0148]
表2：暴露于预消化的对照配方物或实验配方物的肠道肠上皮细胞的乳糖酶活性，以mu/mg蛋白计。
[0149][0150]
*p值通过t
‑
检验、2尾、双样本等方差确定。
[0151]
在分化的肠上皮细胞中，乳糖酶活性增加，随后蔗糖酶活性增加，之后刷状缘乳糖酶活性开始下降。由于在测量时细胞没有显示乳糖酶活性(数据未显示)，因此增加的乳糖酶活性表明更加分化的细胞状态。
[0152]
细胞增殖试验
[0153]
将隐窝样人结肠癌ht
‑
29细胞以5.104接种在dmem中的96孔nunc
tm
edge板中，dmem中具有10％fcs、1％青霉素/链霉素和1g/l半乳糖。使细胞吸附30小时，之后用在无胎牛血清的培养基中稀释的消化的if替换培养基，最终浓度为0.23％、0.17％和0.085％(w/v)，一式三份。在培育72小时后，不同的细胞增殖速率导致不同的细胞蛋白质含量，这些是通过使细胞裂解，随后根据制造商的说明书使用thermo fischer，pierce bca蛋白质分析试剂盒测量蛋白质含量进行测量的。
[0154]
如用预消化的实验测试婴儿配方物处理的细胞中增加的细胞蛋白质含量所显示的，与预消化的对照配方物相比，细胞增殖显著增加(表3)。
[0155]
表3：暴露于预消化的对照配方物或实验配方物的肠道肠上皮细胞的增殖(细胞蛋白质ug/孔)，以mu/mg蛋白计。
[0156][0157]
*p值通过t
‑
检验、2尾、双样本等方差确定。
[0158]
为实现其作为外部环境屏障的功能，必须不断更新肠上皮细胞。肠上皮细胞的生长和更新取决于肠道隐窝中增殖的细胞。因此，预期刺激细胞增殖速率将支持肠道屏障功能。
[0159]
实施例3：β1,3
’‑
半乳糖基乳糖和2’岩藻糖基乳糖防止肠道屏障破坏和防止通透
性增加
[0160]
β1,3
’‑
半乳糖基乳糖(β3
’‑
gl)、β1,4
′‑
半乳糖基乳糖(β4
’‑
gl)和β1,6
′‑
半乳糖基乳糖(β6
’‑
gl)从carbosynth(berkshire，uk)获得。α1,3
’‑
半乳糖基乳糖(α3
’‑
gl)从elicityl(crolles，france)获得。将纯化的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxydivalenol)(don)(d0156；sigma aldrich，st luis，mo，usa)溶解于纯乙醇中，并在
‑
20℃下储存。人上皮结直肠腺癌(caco
‑
2)细胞从美国典型组织保藏中心(american type tissue collection)(代码htb
‑
37)(manasse，va，usa，第90
‑
102代)获得。
[0161]
根据确定的方法使用caco
‑
2细胞。简言之：将细胞在dulbecco改良的eagle培养基(dmem)中培养，并以0.3x105细胞的密度接种到置于24孔板中的具有聚对苯二甲酸乙二醇酯膜(bd biosciences，franklin lakes，nj，usa)的0.3cm2高孔密度(0.4μm)的插入物中。将caco
‑
2细胞保持在37℃下95％空气和5％co2的湿润气氛中。在培养17
‑
19天后，获得融合的单层，通过millicell
‑
electrical resistance system伏特计(millipore，temecula，ca，usa)测量的平均跨上皮电阻(teer)超过400ωcm2。
[0162]
caco
‑
2细胞单层因此在transwell系统——其是肠道屏障功能的模型——中生长。在暴露于真菌毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)——其是损害肠道屏障的触发剂和模型化合物——之前，用不同的gl(包括β3
’‑
gl、α3
’‑
gl、β4
’‑
gl和β6
’‑
gl)以0.75重量％浓度的gl将单层预处理24小时。将don在完全细胞培养基中稀释至4.2μm的最终浓度，并添加到transwell插入物的顶侧和基底外侧。该don浓度不影响caco
‑
2细胞的活力。用don培育24小时。
[0163]
进行跨上皮电阻(teer)和荧光黄(ly)通透性测量以研究屏障完整性。对于teer测量，使用连接到一双筷子电极的millicel
‑
ers伏特计来测量teer值。结果表示为初始值的百分比。对于细胞间示踪剂通量测定，将膜不透性荧光黄(ly)(sigma，st luis，mo，usa)以16μg/ml的浓度加入到transwell板中的顶端区室中，保持4小时，并使用激发波长和发射波长分别设为410nm和520nm的分光光度荧光计(fluostar optima，bmg labtech，offenburg，germany)通过测量基底外侧区室中的荧光强度来测定细胞间通量。在caco
‑
2transwell插入物的顶侧和基底外侧的培养基中对白细胞介素
‑
8(il
‑
8或cxcl8)——其是炎症的典型标志物——响应于治疗的释放进行定量。根据制造商的说明书使用人l
‑
8elisa测定法(bd biosciences，pharmingem，san diego，ca，usa)来测量cxcl8浓度。关于材料和方法的更多详细信息，参见akbari等人,2016,eur j nutr.56(5):1919
‑
1930。
[0164]
结果示于图1a、b、c和d以及图2中。图1显示了不同半乳糖基乳糖(gl)对don诱导的caco
‑
2细胞单层完整性损害的影响。图1a和1b显示了不同gl的跨上皮电阻(teer)。图1c和1d显示了荧光黄(lyf)向基底外侧区室的移位。teer表示为初始值的百分比，lyf以ng/cm2xh表示。α3
’‑
gl为gal(α1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc；β3
’‑
gl为gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc；β4
’‑
gl为gal(β1
‑
4)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc’；β6
’‑
gl为gal(β1
‑
6)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc。数据为平均值
±
s.e。*：与对照相比，p<0.05；**：与对照相比，p<0.01；*＊*：与对照相比，p<0.001；^：与don对照相比，p<0.05；^^：与don对照相比，p<0.01；^^^：与don对照相比，p<0.001。
[0165]
从图1a
‑
d中可以看出，don的存在破坏了屏障功能，如don对照样品的teer值降低和ly通量增加所显示。此外，don的存在增加了cxcl8(il
‑
8)释放，如图2中所示。图1a
‑
d进一步显示，β3
’‑
gl的存在防止了don诱导的上皮屏障完整性的丧失，如通过增加的teer值和减
少的don影响的穿过肠上皮细胞单层的ly通量所测量的。β4
’‑
gl和β6
’‑
gl对肠上皮细胞屏障功能没有显示显著性影响。有趣的是，β3
’‑
gl(即具有β1
‑
3糖苷键的半乳糖基乳糖)可有效保护肠道屏障功能，而α3
’‑
gl(即具有α1
‑
3糖苷键的半乳糖基乳糖)不能防止don诱导的肠道屏障破坏。相反，所有的半乳糖基乳糖均能够降低don诱导的il
‑
8释放，如图2中所示。
[0166]
这些结果表明β3
’‑
gl(本文中也称为β1,3
’‑
半乳糖基乳糖或gal(β1
‑
3)
–
gal(β1
‑
4)
–
glc)对保护肠上皮细胞屏障功能的特定效果、特别是在有挑战的条件下，所述效果超出了和/或独立于防止炎性应答的效果，和/或对微生物群的效果或通过微生物群的效果。因此，这些结果表明β3
’‑
gl具有增加肠道屏障功能和/或防止和/或治疗肠道屏障破坏的效果。此外，这些结果也表明β3
’‑
gl对治疗、预防和/或缓解受试者中与毒素暴露相关的病症的效果，特别是当毒素为单端孢霉烯(tricothecene)毒素时，并且更特别是当毒素为脱氧雪腐镰刀菌烯醇时。
[0167]
在一个单独的实验中，在相同的模型中测定2’岩藻糖基乳糖对teer和lyf通量的影响。以1mg/ml的浓度测试2
’‑
fl，并且发现2
’‑
fl在统计学上明显防止don诱导的teer降低和lyf增加，参见表4。这表明2’fl对肠道屏障功能具有有利效果。因此，该实施例表明，当将2’fl和β3
’‑
gl组合时，组合物中对肠道屏障功能的效果进一步改善。
[0168]
表4：2
’‑
fl对don诱导的caco
‑
2细胞单层完整性损害的影响
[0169][0170]
*＊*与没有don的对照相比，p<0.001。
[0171]
^^与具有don的对照相比，p<0.01；^与具有don的对照相比，p<0.05。
[0172]
实施例4：丁酸改善肠道屏障功能
[0173]
检查丁酸对肠道屏障功能的效果。
[0174]
方法
[0175]
t84人肠上皮细胞通常用于体外研究肠道屏障完整性。将t84细胞(atcc，usa)在具有青霉素
‑
链霉素(100iu/ml)的dmem
‑
f12 glutamax中的12mm transwell插入物(0.4μm，corning costrar，usa)上培养，补充5％fbs
‑
hi。在达到融合14天后使用t84细胞。将在transwell过滤器上培养的t84单层在有或没有丁酸的情况下预培育48小时。随后将这些样品在il
‑
4(25ng/ml)的存在下另外培育48小时。将il
‑
4加入到基底外侧区室中；每24小时更换培养基和添加剂。
[0176]
通过使用上皮伏欧计(evom；world precision instruments，germany)测量跨上皮电阻(teer；ωx cm2)来评估上皮屏障完整性。
[0177]
结果示于表5中，其中给出了相对的teer值。第48h和96h栏是相对于t＝0值的teer增加。il
‑
4处理破坏了肠道屏障功能；然而在丁酸的存在下，这种破坏得到了改善。
[0178]
表5：丁酸对肠道屏障功能的效果。
[0179]
丁酸浓度(mm)在48小时的％teer在96小时的％teer(il
‑
4)
‑
17(12)0(4)479(25)26(16)
[0180]
因此，该实施例表明当将β3
’‑
gl、2
’‑
fl和任选的膳食丁酸组合时，组合物中对肠道屏障功能的效果进一步改善。
[0181]
实施例5：2
’‑
fl和(3
’‑
gl和/或丁酸)对免疫系统的影响不同
[0182]
通过在存在或不存在2
’‑
fl、3
’‑
gl和丁酸，有或没有t细胞特异性刺激的情况下培养人外周血单核细胞(pbmc)来测定免疫细胞活化和应答。
[0183]
材料和方法
[0184]
从健康供体中分离pbmc：从血沉棕黄层(sanquin，amsterdam，the netherlands)中分离出健康供体的人外周血单核细胞(pbmc)。pbmc通过使用leucosep管(greiner bio
‑
one)离心获得。收集pbmc，并在pbs(gibco，thermo fisher technologies) 2％热灭活的fcs(invitrogen)中洗涤，随后用无菌裂解缓冲液(0.15m nh4cl，0.01m khco3和0.1mm edta，在4℃下的ph为7.4，全部来自merck，darmstadt，germany)使红细胞低渗裂解。在裂解后，将pbmc重新悬浮于冷冻培养基(70％rpmi 1640培养基(gibco,thermo fisher technologies)，补充有10％热灭活的fcs和100u/ml青霉素
‑
链霉素、20％热灭活的fcs和10％dmso(sigma))中，并冷冻保存。
[0185]
pbmc活化模型：将pbmc(0.2
·
106个细胞/孔)在96孔平底板(corning)中培养。用2
’‑
fl(jennewein)、3
’‑
gl(0
‑
0.3％w/v；carbosynth)或丁酸钠(0.2mm；sigma aldrich)及其组合将细胞预培育24小时。随后，另外对细胞进行cd3/cd28活化(pelicluster cd3和pelicluster cd28，sanquin)24小时。培育后，通过elisa在上清液中测量ifnγ(参见下文)。为测定刺激后的细胞活性，用细胞增殖试剂wst
‑
1(10μl；roche)和/或10％triton(5μl；阴性对照)培育pbmc。在3小时后，在od450 nm和od650 nm下测量吸光度，并根据制造商的说明书计算细胞活性。
[0186]
pbmc产生ifnγ：用指定试剂培育pbmc，在培育后收集上清液，并根据制造商的说明书使用人ifnγelisa试剂盒(r&d systems europe ltd.)测量介体水平。
[0187]
pbmc产生细胞因子：用指定试剂培育pbmc。在培育后，收集上清液，并基于luminex技术(xmap，luminex austin tx usa)通过进行经验证的多重免疫测定法来测量il2、il6、il10、il13、il21、tnfα、ifnγ、mif、ccl1、ccl13、ccl17、ccl20、ccl22和cxcl8
‑
11水平。用biorad flexmap3d(biorad laboratories，hercules usa)结合xponent软件版本4.2(luminex)进行采集。使用bio
‑
plex manager软件版本6.1.1(biorad)通过5参数曲线拟合分析数据。
[0188]
在pbmc刺激后，收集细胞培养物上清液，然后测量细胞因子应答以测试细胞的免疫应答。将在刺激条件下测量的细胞因子水平校正为在非刺激条件下测量的(低)细胞因子水平。此外，由于每个供体都以其自身的效率对t细胞刺激作出反应，因此通过将干预诱导的应答除以基础的刺激应答来计算细胞因子应答的个体指数。
[0189]
通常认为il2、il6、tnf
‑
α、ccl1、ccl17和ccl20与炎症和/或增殖有关。认为ifn
‑
γ、cxcl9、cxcl10和cxcl11与th1应答有关。认为il13、ccl13和ccl22与th2应答有关。认为il10和galectin
‑
9与treg作用有关，和认为il21与b细胞作用有关。
[0190]
统计分析：使用配对单尾(wilcoxon)t检验对cd3/cd28刺激组与对照组进行比较，认为p<0.05有显著性差异。
[0191]
使用配对双尾(wilcoxon)t检验，对刺激条件下的测量值和计算值的相对平均值
±
sem进行统计学检验，认为p<0.05有显著性差异。单个成分的组合效果的计算值基于每个供体的测量值。
[0192]
通过wst测量的免疫细胞活性在添加2
’‑
fl 24小时后显著增加，而在添加3
’‑
gl后检测到活化降低。丁酸的添加在无刺激条件下或在t细胞刺激条件下(cd3/cd28)均不影响免疫细胞代谢活性。
[0193]2’‑
fl的添加改变了细胞因子应答，而3
’‑
gl的添加没有导致相同的变化。有趣的是，添加3
’‑
gl和2
’‑
fl似乎显著提高2
’‑
fl的性能。此外，在3
’‑
gl和2
’‑
fl产生的应答对细胞的代谢活性相对于ifn
‑
γ产生之间发现差异，表明存在其他免疫应答。
[0194]
总的来说，结论是，分离的人pbmc的总池是多样的免疫细胞池，所述免疫细胞对提供的hmo产生直接和不同的应答。尽管细胞在代谢上变得更有活性，但在2
’‑
fl存在下的细胞因子产生与在3
’‑
gl存在下的细胞因子产生不相等，表明存在差异免疫反应应答。
[0195]2’‑
fl、3
’‑
gl及其组合的结果
[0196]
研究了用2'fl和3'gl及其组合进行共培养对来自10名人供体的pbmc培养物的影响。首先测定了通过cd3/cd28进行的t细胞特异性刺激的效果。
[0197]
在刺激人pbmc后，收集细胞培养物上清液，然后测量细胞因子应答以测试细胞的免疫应答。在用cd3/cd28对t细胞进行特异性刺激后，使用luminex技术在细胞上清液中检测到了数种细胞因子。th2型细胞因子il
‑
4和il
‑
13、趋化因子ccl17显著增加，显示出强劲的t细胞刺激(表6)。
[0198]
表6：与无刺激条件相比，在用cd3/cd28刺激后在pbmc的细胞培养物上清液中测量的细胞因子il
‑
4、il
‑
13和趋化因子ccl17水平(pg/ml)。
[0199][0200][0201]
配对单尾(wilcoxon)t检验：刺激vs无刺激，*p<0.05，**p<0.01，*＊*p<0.001，*＊＊*p<0.0001
[0202]
随后，为测试特定化合物对pbmc活性的直接效果，在用2
’‑
fl、3
’‑
gl中任一种及其组合预培育24小时后，将细胞用cd3/cd28活化24小时。此外，由于每个供体都以其自身的效率对t细胞刺激作出反应，因此通过将干预诱导的应答除以基础的刺激应答(空白设为1)来计算细胞因子应答的个体指数。以这种方式研究了10位不同供体内的干预。
[0203]
il
‑
4和il
‑
13是密切相关的细胞因子，已知调节过敏性炎症的许多方面。它们在调节淋巴细胞、髓样细胞和非造血细胞的应答方面起重要作用。例如：在t细胞中，il
‑
4诱导初始cd4 t细胞分化成th2型t细胞；在b细胞中，il
‑
4驱动免疫球蛋白(ig)类转换成igg1和ige；在巨噬细胞中，il
‑
4和il
‑
13诱导替代性的巨噬细胞活化。
[0204]
表7：使用2
’‑
fl和3
’‑
gl或组合，在cd3/cd28刺激条件下il
‑
4、il
‑
13和ccl17的相对水平。
[0205][0206]
*配对单尾(wilcoxon)t检验：当与2
’‑
fl 3
’‑
gl计算的效果相比时，p<0.05。
[0207]
人pbmc的t细胞刺激导致il
‑
4和il
‑
13显著增加。与对照相比，用2
’‑
fl预培育细胞对il
‑
4和il
‑
13的水平没有效果。然而，与对照相比，在3
’‑
gl的存在下检测到降低。此外，与对照和2
’‑
fl相比，2
’‑
fl和3
’‑
gl的组合诱导显著更低水平的il
‑
4和il
‑
13。有趣的是，这些降低的il
‑
4和il
‑
13水平显著低于可基于2
’‑
fl和3
’‑
gl的各自效果的计算预期的水平，参见表7。
[0208]
这些数据显示，与单独的3
’‑
gl或2’fl相比，细胞在存在2
’‑
fl和3
’‑
gl的组合的情况下，总的pbmc群体内对t细胞刺激的th2型应答的出乎意料的降低。
[0209]
细胞因子在转录水平上调节细胞应答，而趋化因子在将炎性细胞募集到炎症位点中起作用。趋化因子ccl17(胸腺和活化调节趋化因子)是th2淋巴细胞的有效化学引诱剂，并且被认为在炎性疾病如过敏中起重要作用。例如，血清ccl17水平清楚地反映了特应性皮炎的疾病活性，其被认为是以th2为主导的炎性皮肤病，尤其是在急性期。
[0210]
人t细胞刺激导致ccl17显著增加，参见表7。尽管使用2
’‑
fl或3
’‑
gl进行预培育对t细胞刺激的pbmc内的ccl17水平没有显著效果，但与单独的2
’‑
fl和3
’‑
gl相比，当使用2
’‑
fl和3
’‑
gl对活化的pbmc进行预培育时，检测到ccl17水平显著降低。基于各组分诱导的与对照水平相比的变化，可以计算将干预合并时的预期变化。有趣的是，当将t细胞刺激的pbmc在2
’‑
fl和3
’‑
gl组合的存在下培养时，诱导比预期更低的ccl17水平。ccl17水平的变化表明，细胞在存在2
’‑
fl和3
’‑
gl组合的情况下，总的pbmc群体中对t细胞刺激的th2型应答出乎意料的进一步降低。这些ccl17数据与il
‑
4和il
‑
13数据一致。
[0211]
分离的人pbmc的总池是多样的免疫细胞池，所述免疫细胞可对提供的hmo产生直接和不同的应答。尽管细胞在代谢上变得更有活性，但单独的2
’‑
fl暴露没有显著影响th2介体il
‑
4、il
‑
13和ccl17水平，而单独的3
’‑
gl暴露却导致这些介体水平降低。有趣的是，同时暴露于2
’‑
fl和3
’‑
gl在统计学上显著降低il
‑
4、il
‑
13和ccl17水平，从而降低th2型应答。这些数据表明将添加3
’‑
gl和2
’‑
fl具有减少过敏发生的潜力。
[0212]2’‑
fl和丁酸的结果
[0213]
白细胞介素10(il10)不是特定细胞类型的细胞因子，但被许多免疫细胞广泛表达。il10的诱导通常与其他促炎性细胞因子一起发生，尽管诱导il10的途径可能对这些促
炎性细胞因子产生负调控。il10通过限制/调节对病原体的免疫应答，从而防止对宿主的损害，在感染中起核心作用。因此，通常认为il10是调节性细胞因子。在来自10位人供体的外周血单核细胞(pbmc)培养物中测量il 10水平。
[0214]
表8：在无刺激条件下pbmc中的il10水平，表示为与空白值(blanc)相比的相对(标准化)值，从而校正供体变化。
[0215][0216]
*：配对双尾(wilcoxon)t检验，当与计算值相比时p<0.05。
[0217]
在用0.2％2
’‑
fl共培养的人pbmc中，与空白对照相比，检测到il10水平显著升高(p<0.05)，而添加丁酸对il10水平没有效果。与空白对照和0.2mm的丁酸相比，0.2％2
’‑
fl和0.2mm丁酸的组合显著提高il10水平。有趣的是，2
’‑
fl和丁酸的组合将il10增加到比理论上基于各组分可预期的水平更高的水平，参见表8。这表明与单一成分相比，在2
’‑
fl和丁酸的组合的存在下，人pbmc的调控能力出乎意料地、有益地提高。
[0218]
通常，ccl20和ccr6在将未成熟dc及其前体募集到潜在抗原进入位点中起作用。根据组织的微环境(例如局部存在tgf
‑
β、il10或il15)，免疫细胞可获得功能ccr6，从而迁移到产生ccl20的位点。显示ccl20快速地诱导新分离的t淋巴细胞亚群牢固地粘附在细胞间粘附分子
‑
1上。因此，可通过在无刺激条件下调节ccl20来获得调控。
[0219]
表9：无刺激条件下的ccl
‑
20水平，表示为相对值，从而校正供体变化
[0220][0221]
配对双尾(wilcoxon)t检验：当与计算值相比时，*p<0.05，**p<0.01。
[0222]
与空白对照相比，在暴露于2
’‑
fl的人pbmc中检测到ccl20的水平升高，而单独添加丁酸或3
’‑
gl对ccl20水平在统计学上没有显著效果。与空白和单独的丁酸相比，用2
’‑
fl和丁酸的组合培育人pbmc诱导显著更高的ccl20水平。在2
’‑
fl和丁酸的该组合中，另外存在的3
’‑
gl进一步提高了ccl20水平。出乎意料地，观察到的2
’‑
fl和丁酸的组合的水平显著高于可基于单一组分计算得到的水平。当将2
’‑
fl、丁酸和3
’‑
gl的组合的观察值与基于单一组分的理论计算值相比时，情况也是如此，参见表9。
[0223]
这些数据表明，添加2
’‑
fl和丁酸影响人pbmc的免疫应答。另外存在的3
’‑
gl进一步改善了免疫应答。分离的人pbmc的总池是多样的免疫细胞池，所述免疫细胞对提供的hmo产生直接和不同的应答。检测到的il
‑
10以及ccl20水平的变化均表明在2’fl和丁酸的组合的存在下，人pbmc应答得到出乎意料的改善的调节，在存在3’gl时甚至得到进一步改善。
[0224]
实施例6：2
’‑
fl通过微生物群增加了丁酸形成，特别是如果还存在gos
[0225]
将通过剖腹产出生的3月龄的健康婴儿——仅人乳喂养，没有抗生素使用历史——的粪便样本用作接种物，以模拟quad
‑
——人胃肠道的动态模型——的结肠区室中的婴儿肠道微生物群，所述模型包含4个平行运行的单元，并且每个单元由3个模拟胃和小肠、近端结肠和远端结肠的反应器组成。
[0226]
scfa曲线显示，乙酸在远端结肠中含量最高，其次是丙酸(表10)。在scgos/lcfos和scgos/lcfos/2
’‑
fl的存在下，乙酸和丙酸的浓度高于对照组和补充2
’‑
fl的单元。在近端结肠中也见到类似的观察结果(数据未显示)。有趣的是，丁酸在远端结肠产生的更早，并且相对于对照组和scgos/lcfos组，在2
’‑
fl和scgos/lcfos/2
’‑
fl存在下，浓度更高。在scgos/lcfos/2
’‑
fl和scgos/lcfos的存在下，远端结肠中的异丁酸——由蛋白质水解发酵产生的支链scfa——的水平降低。
[0227]
表10：在第1天至第3天(d1
–
d3)、第4天至第11天(d4
–
d11)和第12天至第15天(d12
–
d15)，在未补充的(对照)和补充的单元中的远端结肠中产生的短链脂肪酸。
[0228][0229]
糖谱数据表明，2
’‑
fl在单独补充时不会被代谢，而仅在scgos/lcfos的存在下被利用，在这种情况下2
’‑
fl在近端结肠和远端结肠中缓慢代谢。包括scgos在内的所有其他碳水化合物在第一个小时内在近端结肠中被消耗掉。
[0230]
显示2
’‑
fl仅在其他gos、特别是gos/lcfos的存在下发酵，从而形成了微生物群生态系统，其被认为具有健康益处。
[0231]
scgos/lcfos/2
’‑
fl促进了丁酸的产生，对于肠道屏障功能，丁酸是一种重要的scfa。scgos/lcfos/2
’‑
fl导致异丁酸水平出人意料地低，这表明结肠中蛋白水解活性较低。
[0232]
实施例7：2
’‑
fl、3
’‑
gl和丁酸对微生物群中病原体的抑制
[0233]
在biolector pro微流体微型多发酵罐中测试粪便浆液样品中的厌氧发酵。从母乳喂养的婴儿和配方物喂养的婴儿中收集粪便浆液样品。通过将0.6克粪便加入到40ml baby reichardt v.6培养基 粘液 硫酸铵 乳酸和乙酸中来处理这些粪便浆液样品。将所得溶液插入biolector pro微流体微型多发酵罐中。测试支线(test leg)补充有3
‑
gl、2
’‑
fl、3
‑
gl 2
’‑
fl和gos/fos。对照支线补充有无菌水。
[0234]
此外，测试支线还补充有艰难梭菌(clodtridium difficile)c153(艰难梭菌琼脂(difficile agar))、肠炎沙门氏菌(salmonella enteriditis)s29(xld琼脂)、cronobacter sakasakii e71(显色琼脂)或肺炎克雷伯杆菌(klebsiella pneumonia)k2(simons柠檬酸肌醇琼脂)。对于每个dno和对照，还制备了无病原体培养物。
[0235]
在发酵后，测试发酵溶液的scfa含量(特别是乙酸、丙酸、丁酸和异丁酸)、氨含量、乳酸含量和病原体浓度。还进行dna分离 鉴定和16s测序以确定微生物群的组成。
[0236]
使用可处理低ph的32孔板。该板的孔中充满粪便溶液。根据模板(template)，将2.5％(w/v)的不同的无菌碳水化合物溶液(3
’‑
gl、2
’‑
fl、2
’‑
fl/3
’‑
gl(2.0 0.5％))和葡萄糖加入到粪便浆液中。
[0237]
开始实验，ph设定值为5.5(来自婴儿1的面部接种物，婴儿1阴道出生，母乳喂养，5
月龄)或ph 6.0(来自婴儿2的接种物，婴儿2阴道出生，母乳喂养，5月龄)，持续调节ph，温度37℃，湿度85％，od对照。在4、8和24小时，进行取样，并在tos
‑
丙酸mup琼脂上(总的双歧杆菌)、xld琼脂(对于肠炎沙门氏菌s29)和simons柠檬酸肌醇琼脂(对于肺炎克雷伯杆菌k2和scfa)上进行cfu测定，以及进行d
‑
乳酸和l
‑
乳酸以及氨分析。使用粪便颗粒进行16sdna测序。
[0238]
对于两种接种物，与单独的3
’‑
gl或2
’‑
fl相比，使用3
’‑
gl/2
’‑
fl的组合的发酵程度(通过naoh消耗即酸产生测量)最高。3
’‑
gl和3
’‑
gl/2
’‑
fl的初始酸化速率高。通常，单独的2
’‑
fl导致较慢和较低的酸化。由于反应容器中可发酵的碳水化合物的量相同，因此组合的更高的总酸化度表明2
’‑
fl和3
’‑
gl的组合具有出乎意料的协同效果。所产生的scfa大部分为乙酸。还产生了l
‑
乳酸。
[0239]
使用3
’‑
gl、2
’‑
fl和混合物2
’‑
fl/3
’‑
gl观察到双歧杆菌生长，并且一般而言，生长刺激非常相似。然而，对于婴儿1，使用3
’‑
gl/2
’‑
fl混合物在24小时观察到最高水平。还观察到肠杆菌科(enterobacteriaceae)的生长，并且在测试条件下非常相似，但对于婴儿1的接种物，对于2
’‑
fl/3
’‑
gl的组合，在8小时最低。在该时间点的16s微生物群测序数据显示，变形菌门(proteobacteria)(主要供体是埃希氏杆菌属(escherichia))相对减少。在发酵结束时，当碳水化合物耗尽时，2
’‑
fl/3
’‑
gl喂养的微生物群比对照组(葡萄糖和空白)能够保留更多的阳性微生物群组成。对于婴儿2的接种物，对双歧杆菌的效果在3
’‑
gl的存在下最高，并且当使用3
’‑
gl/2
’‑
fl的组合时，对肠杆菌科的生长抑制效果最好。
[0240]
通常，在容器中掺入病原体混合物的条件下，与不掺入病原体的条件下相比，观察到酸化略有降低。然而，通过naoh消耗量确定的2
’‑
fl、3
’‑
gl和2
’‑
fl/3
’‑
gl对酸化的效果不受影响，并且再次地，对于两种接种物，使用3
’‑
gl/2
’‑
fl时最高。对于婴儿1的接种物，沙门氏菌生长受2
’‑
fl的限制最大，而克雷伯氏菌属(klebsiella)生长受3
’‑
gl/2
‑’
fl的组合的抑制最大。对于婴儿2的接种物，沙门氏菌生长受2
’‑
fl的限制最大，而克雷伯氏菌属生长受3
’‑
gl或3
’‑
gl/2
‑’
fl的组合的抑制最大。对于两种接种物，艰难梭菌(cdifficile)的向外生长在所有条件下均受限制。
[0241]
这些结果表明2
’‑
fl和3
’‑
gl的组合对肠道微生物群功能和组成的改善效果超出了2
’‑
fl单独或3
’‑
gl单独的效果。
[0242]
实施例8：婴儿配方物
[0243]
在将13.7g粉末复原至100ml的最终体积后，旨在用于0至6月龄婴儿的婴儿配方物每100ml包含：
[0244]
‑
66kcal，
[0245]
‑
1.3g蛋白质(乳清蛋白/酪蛋白重量比1/1)，
[0246]
‑
7.3g可消化的碳水化合物(主要为乳糖)，
[0247]
‑
3.4克脂肪(其中约50重量％为牛乳脂，其余为植物油、鱼油和微生物油)。基于总的脂肪酸计，丁酸的量为1.48重量％，花生四烯酸的量为0.52重量％，二十碳五烯酸的量为0.11重量％，二十二碳六烯酸的量为0.52重量％，
[0248]
‑
0.9g不可消化的低聚糖，其中0.1g 2
’‑
fl(来源jennewein)、0.08g长链低聚果糖(来源raftilinehp)、0.72g低聚半乳糖(其中约25mg通过发酵获得的3’半乳糖基乳糖，其余为来自vivinal gos的低聚半乳糖)，
[0249]
‑
根据婴儿配方物指令的矿物质、维生素、痕量元素和其他微量营养素，
[0250]
‑
配方物的一部分，基于干重计约26重量％，衍生自嗜热链球菌和短双歧杆菌(b.breve)菌株发酵的lactofidus产物，产生基于组合物的干重计约28重量％的乳酸，其中大于95重量
[0251]
％为l形式。
[0252]
实施例9：后续配方物
[0253]
在将14.55g粉末复原至100ml的最终体积后，旨在用于大于6月龄婴儿的后续配方物每100ml包含：
[0254]
‑
68kcal，
[0255]
‑
1.36g蛋白质(乳清蛋白/酪蛋白重量比4/6)，
[0256]
‑
8.1g可消化的碳水化合物(主要为乳糖)，
[0257]
‑
3.2克脂肪(其中约50重量％为牛乳脂，其余为植物油、鱼油和微生物油)。基于总的脂肪酸计，丁酸的量为1.47重量％，花生四烯酸的量为0.29重量％，二十碳五烯酸的量为0.12重量％，二十二碳六烯酸的量为0.56重量％，
[0258]
‑
0.85g不可消化的低聚糖，其中0.05g 2
’‑
fl(来源jennewein，名称？)、0.08g长链低聚果糖(来源raftilinehp)、0.72g低聚半乳糖(其中约25mg通过发酵获得的3’半乳糖基乳糖，其余为来自vivinal gos的低聚半乳糖)，
[0259]
‑
根据婴儿配方物指令的矿物质、维生素、痕量元素和其他微量营养素，
[0260]
‑
配方物的一部分，基于干重计约26重量％，衍生自嗜热链球菌和短双歧杆菌菌株发酵的lactofidus产物，产生基于组合物的干重计约0.28重量％的乳酸，其中大于95重量％为l形式。
[0261]
实施例10：幼儿配方物
[0262]
在将15.07g粉末复原至100ml的最终体积后，旨在用于大于12月龄至最高达36月龄幼儿的后续配方物每100ml包含：
[0263]
‑
65kcal，
[0264]
‑
1.3g蛋白质(乳清蛋白/酪蛋白重量比4/6)，
[0265]
‑
8.7g可消化的碳水化合物(主要为乳糖)，
[0266]
‑
2.6克脂肪(其中约10重量％为牛乳脂，其余为植物油、鱼油)。基于总的脂肪酸计，丁酸的量为约0.35重量％，二十碳五烯酸的量为0.42重量％，二十二碳六烯酸的量为0.63重量％，
[0267]
‑
1.22g不可消化的低聚糖，其中0.02g 2
’‑
fl(来源jennewein，名称？)、0.12g长链低聚果糖(来源raftilinehp)、1.08g低聚半乳糖(其中约17mg通过发酵获得的3’半乳糖基乳糖，其余为来自vivinal gos的低聚半乳糖)，
[0268]
‑
根据婴儿配方物指令的矿物质、维生素、痕量元素和其他微量营养素，
[0269]
‑
配方物的一部分，基于干重计约18重量％，衍生自嗜热链球菌和短双歧杆菌菌株发酵的lactofidus产物，产生基于组合物的干重计约0.2重量％的乳酸，其中大于95重量％为l形式。