一种与番茄抗灰霉病相关的CircRNA及应用的制作方法

一种与番茄抗灰霉病相关的circrna及应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与番茄抗灰霉病相关的circrna及应用。


背景技术：

2.番茄是全世界产量最高的农作物之一。同时，番茄也是多发病作物，由于病虫的危害经常造成世界性大面积减产。在我国，随着保护地种植面积的扩大及连作时间的延长，尤其是我国北方冬季设施内高湿、低温、弱光的环境条件；利于多种病原物积累和传播。病害问题成为制约设施番茄生产的重要因素。
3.灰霉病是番茄生产中重大病害，灰霉病寄主范围广，危害部位多，传播快，分生孢子萌发温度较宽，发病要求较高湿度。当前设施栽培的防治手段主要以化学防治为主，虽然防治高效快捷，但是负面影响也逐年显现，污染产品，农药残留超标；病原菌产生抗药性破坏生态平衡；农药的残留污染环境。近年来，农副产品的出口业务由于农药的严重污染也付出了沉重代价。
4.环状rna(circrna)是一种新型的、内源性的非编码rna。随着高通量测序的技术的成熟、成本大幅降低，使得circrna逐渐受到人们的关注。由于circrna分子呈环状，性质稳定，rna水解酶无法结合以及降解circrna。在许多物种中保守存在的cricrna往往表现出组织或发育阶段的表达差异性。所以医学上把circrna作为疾病发生和发展的生物标记物来使用。另外有些circrna具有mirna海绵作用，在circrna
‑
mirna
‑
mrna的调节体系中起作用，如癌症、动脉硬化、心脏病等。目前circrna的分子海绵功能在人类疾病方面取得非常大的成绩，circrna广泛存在多种植物物种中，但植物病害相关circrna功能的研究鲜见报道。因此寻找番茄抗灰霉病相关的circrnas并进行遗传研究成为当前番茄抗病研究的新方向。还可以加速番茄circrna的功能挖掘与应用工作。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明目的在于提供一种与番茄灰霉病相关的circrna基因，所述circrna基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。
6.本发明还提供了一种用于扩增权利要求1所述的circrna基因的引物对，用于扩增275环化位点的引物对为seq id no:2和seq id no:3。
7.本发明还提供了一种包含所述的circrna基因的重组表达载体。
8.本发明还提供了所述的circrna基因在植物组织中番茄灰霉病表达量检测中应用。
9.进一步地，通过在所述植物中过表达或抑制表达circrna基因。
10.进一步地，所述植物为番茄。
11.进一步地，植物组织表达量检测为植物抗病性鉴定及遗传育种改良。
12.有益效果：本发明公开了一种circrna基因，并验证该基因与番茄灰霉病相关，并可通过该基因检测番茄灰霉病表达量，具有明显效果。
具体实施方式
13.下述非限定性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
14.实施例1
15.1、rna的提取
16.使用植物rna提取试剂盒(dp441)按照标准说明书操作步骤提取番茄总rna。用普通琼脂糖凝胶电泳(胶浓度1.2％；0.5
×
tae电泳缓冲液；160v，15min)检测完整性。用分光光度计测定od值并计算rna含量。使用随机引物逆转录成cdna，逆转录试剂盒使用prime script tmrt master mix(perfect real time)。
17.2、基因克隆
18.设计一组引物：
19.seq id no.2：5
′‑
agaagcagacccgtcattagct
‑3′
20.seq id no.3：5
′‑
tgatggaaatcagttgggacaa
‑3′
21.对275环化位点进行pcr扩增：20ul反应体系中，10ul prime star master mix，上下游引物各0.3um，模板1ul，用水补齐至20ul，程序如下：98℃ 10s，55℃5s，72℃10s 34个循环；72℃延伸5mins。
22.通过1.5％琼脂糖凝胶电泳分离pcr产物，并用sanprep柱式dna胶回收试剂盒(b518131)按照标准操作步骤进行纯化。并连接到t1载体上，转化大肠杆菌dh5α，利用菌落pcr筛选阳性克隆，送至上海生工进行测序，确认正确后，得circrna基因，核苷酸序列如seq id no.1所示。
23.实施例2
24.将感染了灰霉病作为实验组，正常健康番茄作为对照组，检测实验组和对照组番茄中circrna基因的表达量进行检测。采用pcr方法，引物如seq id no.2何seq id no.3所示。
25.结果表明，感染了灰霉病的番茄circrna基因的表达量明显高于正常健康番茄。证明本发明所述circrna基因可用于检测番茄组织中灰霉病表达量，为进一步通过circrna基因防控番茄灰霉病的发生打下基础。


技术特征：
1.一种与番茄灰霉病相关的circrna基因，其特征在于，所述circrna基因的核苷酸序列如seq id no:1所示。2.一种用于扩增权利要求1所述的circrna基因的引物对，其特征在于，用于扩增275环化位点的引物对为seq id no:2和seq id no:3。3.权利要求1所述的circrna基因在植物组织中番茄灰霉病表达量检测中应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，通过在所述植物中过表达或抑制表达circrna基因。5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述植物为番茄。6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，植物组织表达量检测为植物抗病性鉴定及遗传育种改良。

技术总结
一种与番茄抗灰霉病相关的CircRNA及应用，属于生物技术领域。一种与番茄灰霉病相关的CircRNA基因，所述CircRNA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的CircRNA基因可实现对番茄组织中番茄灰霉病表达量进行检测，具有广泛的应用前景。有广泛的应用前景。


技术研发人员：董国坚 姚天遥 陈思羽 李琳琳
受保护的技术使用者：大连民族大学
技术研发日：2020.11.24
技术公布日：2021/11/4