治疗癌症的方法和组合物与流程

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技术领域：
一方面，提供用于治疗瘤形成(neoplasia)，例如肿瘤的方法和组合物，所述方法和组合物包含a)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物和b)单乙酰基二酰基甘油化合物，例如1-棕榈酰-2-亚麻油酰-3-乙酰甘油(PLAG)。
背景技术：
癌症的特征是异常且不受控制的细胞生长。癌症可以涉及体内的任何组织，并且可以扩散到起源组织之外。不受控制的增殖和其他细胞异常可导致癌性肿瘤的形成。肿瘤可以破坏其起源组织和其功能，并且当癌细胞发生转移时，继发性肿瘤可以在原发生长部位附近或不同部位发展。癌症的病因与各种化学物质，病毒，细菌和环境暴露有关。当前的癌症疗法，例如放射治疗和各种化学疗法，已经造成严重的毒性和其他副作用。其中，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的使用导致作为靶标去除的癌性肿瘤的非期望的生长。参见，例如，Voloshin等人，Blood，118(12):3426-3435(2011)。因此，希望有改进的癌症疗法。技术实现要素：一方面，我们现在提供用于治疗和预防癌症患者的新疗法。在特定方面，提供用于减少或抑制患者肿瘤生长的方法和组合物，包括已经接受或将接受粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物的患者。一方面，本方法包含对受试者例如患有肿瘤或其他瘤形成的人施用治疗有效量的：a)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物；和b)式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物：其中，R1和R2独立地是包含14至20个碳原子的脂肪酸基团。a)G-CSF化合物和式(1)的b)单乙酰基二酰基甘油化合物以组合或其他协调方式适当地施用于患者。在优选的方面，所述b)单乙酰基二酰基甘油是式2化合物:所述式(2)化合物也称为PLAG(1-棕榈酰基-2-亚麻油酰基-3-乙酰甘油)或EC-18。重要的是，我们现在发现使用单乙酰基二酰基甘油化合物如PLAG可以减少癌症肿瘤体积。当患者正在接受G-CSF化合物治疗时，可能会发生这种肿瘤体积癌症减少，与在没有与单乙酰基二酰基甘油化合物联合施用的情况下，用G-CSF化合物治疗可能发生的肿瘤体积增加形成对比。参见下面的实施例1的结果。另一方面，还向受试者施用不同于a)G-CSF化合物的c)另外的化疗剂和b)式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物。例如，所述不同的化疗剂可以是环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美司钠(mesna)、顺铂(cisplatin)、吉西他滨(gemcitabine)和/或他莫昔芬(tamoxifen)，或一种或多种的其他化疗剂。在某些方面，在将式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物与G-CSF化合物一起协同施用之前，受试者将预先接受G-CSF化合物的治疗，但没有使用式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物。例如，患者可能已经在不施用单乙酰基二酰基甘油化合物的状态下接受结合化疗方案的G-CSF治疗。在此类G-CSF疗法的1、2、3、4、5、6或7天、或2、3或4周或更长时间后，可将式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物，例如PLAG配合持续的G-CSF施用下施用于患者。另一方面，提供包含a)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物和b)单乙酰基二酰基甘油化合物例如PLAG(1-棕榈酰基-2-亚麻油酰基-3-乙酰甘油)的药物组合物。优选的药物组合物适用于治疗受试者的癌症，包括实体瘤。又一方面，提供用于治疗或预防包括实体瘤在内的瘤形成的试剂盒。本发明的试剂盒可适当地包含a)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物；b)单乙酰基二酰基甘油化合物，例如PLAG(1-棕榈酰基-2-亚麻油酰基-3-乙酰甘油)。优选地，试剂盒将包含治疗有效量的G-CSF化合物和单乙酰基二酰基甘油化合物，例如PLAG。优选的试剂盒还可以包含使用PLAG和G-CSF化合物治疗癌症，例如实体瘤的说明。所述说明可以适当地采用书面形式，包括作为产品的标签。附图说明图1A是为了评估EC-18与G-CSF的组合在荷瘤小鼠(tumor-bearingmice)中的作用的实验方案。对照组用PBS处理(4只小鼠，对照)，实验组为用G-CSF施用组(5只小鼠，PEG-G-CSF)、吉西他滨施用组(5只小鼠，吉西他滨)、G-CSF和吉西他滨联合施用组(5只小鼠，Gem PEG)和EC-18联合施用组(5只小鼠，Gem PEG EC-18)。图1B显示图1A实验中的小鼠的体重，肿瘤重量，肿瘤重量与体重的比率以及脾脏重量的变化。图1C显示图1A实验中荷瘤小鼠的肿瘤照片。图2A显示图1A实验中荷瘤小鼠的肿瘤大小。图2B是表示图2A中曲线的数值的表。图3A-3B显示通过PLAG处理对TAN((肿瘤相关嗜中性粒细胞)和G-CSF共培养物(co-culture)中的乳腺癌细胞的异常转移的抑制。图3A显示在TAN和G-CSF共培养物的环境中，PLAG处理对乳腺癌细胞移动性的减少是有效的。细胞骨架表现出绿色萤光，细胞核被PI染色。图3B显示细胞侵入试验(transwellinvasionassay)用于证实在TAN以及G-CSF共培养物环境中，PLAG处理对癌细胞异常侵入的抑制。图4A-4D显示通过PLAG处理的TAN和G-CSF共培养物中乳腺癌细胞的上皮-间质转化(EMT)标记表达的变化。图4A显示凝胶分离法用来验证EMT标记基因的表达。图4B-4D显示使用ImageJ将靶标基因(图4B：snail/肌动蛋白；图4C：波形蛋白/肌动蛋白；和图4D：NCAD/肌动蛋白)亮带(band)的强度进行定量。图5A-5B显示通过PLAG处理在TAN和G-CSF共培养物中乳腺癌细胞的细胞因子表达的变化。图5A显示通过ELISA证实作为癌细胞的异常转录激活剂的TGF-β的分泌。图5B显示通过ELISA定量验证癌细胞活化抑制剂IFN-γ的分泌水平。图6A-6B显示通过PLAG处理引起的TGF-β信号通路变化。图6A显示通过西方墨点法证实通过PLAG处理的Smad蛋白活性程度。图6B显示通过IP法证实通过PLAG处理引起的Smads复合物形成的变化。图7显示通过PLAG处理引起的Smad2/3易位变化。Smad2/3蛋白的核定位透过PLAG处理使用共聚焦(confocal)进行定性验证。具体实施方式术语PLAG、EC-18和1-棕榈酰基-2-亚麻油酰基-3-乙酰甘油在本文中可互换使用并在本文中表示相同的化合物。定义本文使用的缩写具有它们在化学和生物领域中的常规含义。根据化学领域中已知的化学价(chemicalvalency)的标准规则建构本文中阐述的化学结构和化学式。对于本领域技术人员而言显而易见的是，本文揭露的某些化合物可以互变异构形式存在，所述化合物的所有此类互变异构形式都是在本发明的范围内。本文中使用的术语“一个(a)”或“一个(an)”是指一个或更多。例如，单数形式的“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”也意旨包括复数形式，除非上下文另有明确说明。当在本说明书中使用时，术语“包含(comprise)”、“包括(include)”、“具有(have)”等将进一步理解，指定所述特征、范围、整数(integer)、步骤、过程、操作、元素和/或组件的存在但不排除存在或增加一个或多个的其他特征、区域、整数、步骤、过程、操作、元素、组件和/或它们的组合。“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的载体”是指本发明的组合物中可以包括有助于向受试者施用活性剂和被受试者吸收并且而不对患者造成显著不利的毒物学(toxicological)影响的物质。药学上可接受的赋形剂的非限制性示例包括水、NaCl、生理盐水、乳酸林格氏液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、分解剂、润滑剂、涂料、甜味剂、调味剂、盐溶液(例如林格氏液)、醇类、油、明胶、碳水化合物如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷(polyvinylpyrrolidine)和色素等。如果需要，此类制剂可以灭菌，可以与辅助剂混合，像是润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、影响渗透压的盐类、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等，不会与本发明的化合物产生有害反应。本领域技术人员将识出其他药物赋形剂可用于本发明。如本文所用的“治疗”和“治疗”包括预防性治疗。治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的活性剂。施用步骤可以由单次施用或可以包括一系列施用所组成。治疗时间的长短取决于多种因素，例如病情的严重程度、患者的年龄、活性剂的浓度、治疗中使用的组合物的活性或是其组合。还应当理解的是，用于治疗或预防的药剂的有效剂量可以在特定治疗或预防方案的过程中增加或减少。通过本领域已知的标准诊断检测可以使剂量的变化变得明显。在某些情况下可能需要长期施用。例如，将组合物以足以治疗患者的量和持续时间施用于受试者。术语“治疗”及其耦合物，可包括预防受伤、病变、病情或疾病。在某些实施例中，治疗是预防。在某些实施例中，治疗不包括预防。术语“预防”是指减少患者疾病症状的发生。如上述，预防可以是完全的(例如，没有可侦测的症状)或部分的，使观察到的症状比不进行治疗时可能发生的症状还要少。“患者”、“受试者”、“有需要的患者”和“有需要的受试者”在本文中可互换使用并且是指可通过施用如本文提供组合物的药物治疗的患有或易于患有疾病或病情的生物体。非限制性示例包括人、其他哺乳动物、牛、大鼠、小鼠、狗、猴、山羊、绵羊、乳牛、鹿和其他非哺乳动物。在一些实施例中，患者或受试者是人。“有效量”或“治疗有效量”是相对于不存在所述化合物可足以让化合物完成载明的目的(例如实现其施用效果、治疗疾病、降低酵素活性、增加酵素活性、减少异化代谢酵素活性、或减少疾病或病情的一种或多种症状)的量。“有效量”的示例是足以有助于治疗、预防或减轻疾病的一种或多种症状的量，其也可称为“治疗有效量”。一个或多个症状的“减少”(以及等同所述短语语法的词语)意味着症状的严重性或频率的降低，或消除症状。药物的“预防有效量”是指当施用于受试者时将具有预期的预防效果的药物量，例如预防或延迟损伤、疾病、病变或病情的发作(或复发)、或降低损伤、疾病、病变或病情或其症状发作(或复发)的可能性。完全的预防作用不一定通过一次的施用剂量而发生，并且可能仅在施用一系列剂量后发生。因此，预防有效量可以在一次或多次施用中施用。如本文所使用，“活性降低量”是指相对于不存在拮抗剂时降低酶活性所需的拮抗剂的量。如本文所用，“功能破坏量”是指相对于不存在拮抗剂，破坏酵素或蛋白质的功能时所需的拮抗剂的量。其确切的量将取决于治疗的目的，并且将由本领域技术人员使用已知技术确定(参见，例如Lieberman，PharmaceuticalDosageForms(vols.1-3，1992)；Lloyd，TheArt，ScienceandTechnologyofPharmaceuticalCompounding(1999)；Pickar，DosageCalculations(1999)；以及Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy，第20版，2003，Gennaro，Ed.，Lippincott，Williams&Wilkins)。如本文所用，在对受试者施用治疗的上下文中的术语“组合”是指为治疗效益使用多于一种的疗法。在施用的上下文中的术语“组合”还可以指当对受试者预防性使用的疗法并且与至少一种额外疗法一起使用时。术语“组合”的使用不受对受试者施用疗法(例如，第一和第二疗法)顺序的限制。第一疗法(例如施用i)G-CSF化合物或ii)式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物，例如PLAG)可以在施用第二疗法(例如施用i)式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物例如PLAG或ii)G-CSF化合物)之前(例如，1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或最多约1周之前)，同时或之后(例如，1分钟、5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时或最多约1周后)向曾患有、患有或易患癌症的受试者(包括已被诊断为实体瘤的受试者)施用。以一定的顺序和时间间隔内向受试者施用治疗，使得治疗可以一起起作用。在一个特定的实施例中，以一定的顺序并在一段时间内向受试者施用治疗，使得他们们提供比以其他方式施用时有更多益处。任何额外的治疗可以与其他额外的治疗以任意顺序进行。术语“增殖性疾病”和“增殖性疾病”是指与异常细胞增殖相关的疾病，例如癌症。“肿瘤”和“瘤形成”或本文所用的相似术语是指由细胞过度生长或增殖而致的任何组织块，无论是良性还是恶性，包括癌前病变。如所讨论的，本方法和组合物包含a)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物；以及b)式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物化合物，例如PLAG。本发明的方法和组合物可以有效地减少或抑制患者体内的肿瘤生长，例如接受a)粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物和b)式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物，如PLAG的治疗的癌症患者。与G-CSF和PLAG的共同治疗下可能导致肿瘤体积减少5、10、15、20、25、30、35、40、45或50％或更多。根据本方法和组合物可以治疗很多类型的癌症。例如，待治疗的癌症可以是实体瘤。可使用本发明的示例性癌症包括但不限于膀胱癌、白血病(例如，白血病、急性淋巴性白血病、急性骨随细胞性白血病、急性成髓细胞性细胞白血病、急性前骨髓细胞白血病、急性骨髓性单核性白血病、急性单核细胞白血病、急性红白血病、慢性白血病、慢性骨髓细胞性白血病、慢性淋巴细胞白血病)、真性红血球增多症、淋巴癌(何杰金氏症(Hodgkin'sdisease)、非何杰金氏症)、华氏巨球蛋白血症、免疫球蛋白巨链病和实体瘤如恶性肉瘤和上皮癌(如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤(Ewing'stumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃和食道癌、卵巢癌、颈颈癌、直肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳突癌、乳头状腺癌、甲状腺囊腺癌、甲状腺髓质癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精母细胞瘤、胚胎癌、维尔姆氏瘤(Wilm'stumor)、子宫颈癌、子宫癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、多形性胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、神经管胚细胞瘤、颅咽瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、寡树突胶质细胞瘤、许旺氏细胞瘤、脑膜瘤、黑色素细胞瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，又称集落刺激因子3(CSF3)，是一种可刺激骨髓中的造血先驱细胞增殖分化为成熟的粒细胞和干细胞并将它们释放进入血液的糖蛋白。在人类中，它以两种活性形式存在，其中较丰富的是174个氨基酸长；另一个是177个氨基酸长。天然存在的G-CSF的药物类似物是人的174个氨基酸肽(rhG-CSF)的重组形式，并且包括：非格司亭(filgrastim)(例如来自Amgen的)，其在大肠杆菌中制备，具有相同的活性，但与天然糖蛋白的区别在于具有N-端蛋氨酸残基且缺乏糖基化；来格司亭(lenograstim)(例如，来自Chugai的)，其在哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中制备，因此基本上与人的G-CSF没有区别；培非司亭(pegfilgrastim)，一种聚乙二醇化形式的非格司亭(例如，来自Amgen的和来自Roche的)，具有20kD的单甲氧基聚乙二醇部分(moiiety)与非格司亭的N端甲硫氨酸残基形成共价键，与非格司亭相比增加溶解度和持续作用时间。本文所指的粒细胞集落刺激因子(G-CSF)包括但不限于所有上述形式。用于制备式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物的化学合成方法显示在例如韩国注册专利第10-0789323号和第10-1278874号中，其内容通过引用并入本文。例如，PLAG可以通过用乙酰基，棕榈酰基和亚麻油酰基官能基酰化甘油的羟基合成。治疗有效量的式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物例如PLAG和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物可从最初细胞培养试验中确定。目标浓度是将能够实现本文描述的方法的那些活性化合物浓度，如使用本文描述的或本领域已知的方法测量的。先前也已经报告式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物例如PLAG和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物的治疗量。如本领域皆知的，也可以从动物模型确定用于人类的治疗有效量。例如，已发现配制达到可以用于人的剂量的浓度对动物是有效。如上述，可以通过监测化合物的效力和向上或向下调整剂量来调整人体剂量。基于上述方法和其他方法调整剂量以在人类中实现最大功效完全属于本领域技术人员的能力范围内。剂量可以根据患者的需求和所使用的化合物而改变。在本发明的上下文中，给予患者的剂量应该足以在患者中随着时间推移产生有益的治疗反应。剂量的大小也将取决于任何不良副作用的存在，性质和程度。决定特定情况的适当剂量在从业者的技术范围内。通常，以低于最佳化合物剂量的较小剂量开始治疗。此后，剂量以小增量增加，直到在情况下达到最佳的效果。可以单独调整剂量和间隔时间以提供对治疗特定的临床适应症有效的施用化合物水平。这将提供与个体疾病状态的严重程度相应的治疗方案。利用本文提供的教导，可以规划有效的预防性或治疗性治疗方案，所述方案不会引起显著毒性，但仍能有效治疗特定患者表现出的临床症状。所述计划应包括通过考虑化合物效力、相对生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重程度，首选施用方式和所选药物的毒性特征等因素来仔细选择活性化合物。给予哺乳动物的剂量和频率(单剂量或多剂量)可以因多种变数而改变，例如，哺乳动物是否患有另一种疾病，以及其施用途径；接受者体型的大小、年龄、性别、健康状况、体重、体重指数和饮食习惯；所治疗的疾病症状的性质和程度、同时治疗的种类、所治疗疾病的并发症或其他相关健康问题。其他治疗方案或药剂可以与申请人发明的方法和化合物结合使用。已确定剂量的调整和操作(例如频率和持续时间)完全在本领域技术人员的能力范围内。本发明的组合物的施用次数没有特别限制，可以一天一次或一天数次并分次施用。式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物例如PLAG和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物可以通过多种途径中的任一种例如局部接触、口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、病灶内、鞘内、鼻内或皮下施用于受试者，或向受试者植入缓释(slow-release)装置，例如微型渗透泵。肠胃外施用包括例如静脉内、肌肉内、小动脉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内和颅内。药物组合物可以包括组合物，其中一种或两种式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物，例如PLAG和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物，所述PLAG化合物为含有治疗有效量的，即以达到预期目的的有效量。对特定应用有效的实际量，尤其取决于所治疗的病症。当在治疗疾病的方法中施用时，此类组合物将包含有效实现所需结果的量的活性成分，例如调节靶分子的活性和/或减少、消除或减缓疾病症状的进展。对于每种制剂而言，药物组合物可以与额外的药学上可接受的载体一起制造。如本文所用，术语“药学上可接受的载体”可以指不刺激生物体并且不抑制所注射化合物的生物活性和特性的载体或稀释剂。本发明没有特别限制可使用的载体的种类，可以使用工业领域中常用的和药学上可接受的任何载体。生理食盐水、无菌水、静脉输液、缓冲盐水、白蛋白注射液、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇是可用载体的非限制性示例。这些载体可以单独使用或者两种以上组合使用。载体可以包括非天然的载体。如果需要，可以添加和使用其他惯用的添加剂如抗氧化剂、缓冲剂和/或抑菌剂。它可以与稀释剂、分散剂、介面活性剂、粘合剂、润滑剂一起配制成如水溶液、悬浮剂、乳液(emulsion)和药丸、胶囊、颗粒剂或药片等注射液。当需要或预期肠胃外应用时，药物组合物中所包括的化合物的特别合适的混合物可以是可注射的、无菌溶液、油或水溶液、以及悬浮剂、乳液或植入体、包括栓剂。尤其是肠胃外施用的载体，包括葡萄糖、生理食盐水、纯水、乙醇、甘油、丙二醇、花生油、芝麻油、聚氧乙烯嵌段(polyoxyethylene-block)聚合物等的水溶液。安瓿是方便的剂量单位。适用于本文提供的药物组合物的药物混合物可包括像是在PharmaceuticalSciences(第17版，MackPub.Co.，Easton，PA)和WO96/05309中描述的，两者的教导在此以引用的方式并入。如上述，还提供试剂盒。例如，在这方面，式(1)的单乙酰基二酰基甘油化合物例如PLAG和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物，其中PLAG化合物可各自适当地包装在标记用于特定治疗的合适容器中。容器可包括PLAG化合物或组合物和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物以及一种或多种适合预期用途的合适的稳定剂、载体分子和/或类似物。在其他实施例中，所述试剂盒进一步包括用于预期治疗的一种或多种治疗试剂，例如一种或多种另外的化学治疗剂。产品可包括内含PLAG化合物或组合物和/或粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物的容器(例如，药瓶、广口瓶、瓶子、袋子等)。此外，制品或试剂盒还可包括例如包装材料、使用说明书、注射器、运送装置，用于治疗或监测需要预防或治疗的病症。产品还可以包括图例(例如，印刷标签或插页或其他描述产品用途的媒介(例如，录音带或录像带))。图例可以与容器相关(例如，固定到容器上)并且可以描述其中的组合物应当被施用的方式(例如，施用的频率和途径)、其适应症和其他用途。组合物可以准备好施用(例如，以适合的剂量单位存在)，并且可包括一种或多种额外的药学上可接受的佐剂(adjuvant)、载体或其他稀释剂和/或额外的治疗剂。或者，所述组合物例可以以具有稀释剂和稀释说明的浓缩形式提供。如上述，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物和单乙酰基二酰基甘油化合物如PLAG，可以与抗瘤形成剂像是化疗剂，例如一种或多种烷化剂(如铂类药物、四嗪、氮丙啶、亚硝基脲、氮芥子气)，抗代谢物(如抗叶酸、氟嘧啶、脱氧核苷类似物、硫嘌呤)，抗微管剂(如长春花生物碱、紫杉烷)，拓扑异构酶抑制剂(例如拓扑异构酶I和II抑制剂)，细胞毒性抗生素(例如蒽环类)和免疫调节药物(例如沙利多迈(thalidomide)和类似物)。在某些方面，化疗剂可以是环磷酰胺、阿霉素、依托泊苷、异环磷酰胺、美司钠、顺铂、吉西他滨和/或他莫昔芬中的一种或多种。粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物和单乙酰基二酰基甘油化合物例如PLAG适当地以协同方式施用，例如同时或依次施用。例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)化合物和单乙酰基二酰基甘油化合物例如PLAG基本上可以同时施用于受试者，或者可以于不同时间向受试者施用药剂，适当地于数小时内，尽管分开施用之间的时间较长也可能是合适的。实施例尽管为了清楚理解，已经通过说明和示例的方式对前述部分进行一些详细描述，对于本领域技术人员来说，根据上述教导来进行某些小改变和修改是显而易见的。因此，不应将描述和示例解释为本文所述的任何发明的范围的限制。本文引用的所有参考文献，包括专利申请和公开，均通过引用整体并入本文。实施例1：EC-18与G-CSF组合对异种移植小鼠中的人骨髓瘤细胞的抗癌作用为了证明式2化合物(EC-18)的施用可以克服由施用G-CSF引起的肿瘤生长的增加，通过向BALB/c7w小鼠皮下注射1x106细胞/100微升(μL)磷酸盐缓冲盐水(PBS)的4T1细胞系来制备荷瘤小鼠(第0天)。在第2天和第3天，对小鼠施用两次的10毫克/公斤(mg/kg)的吉西他滨。于第4天，将PEG-G-CSF(培非司亭)以3μg/小鼠的量通过皮下注射施用一次。于研究的每一天，向小鼠以口服施用以PBS稀释的50毫克/公斤的EC-18。共24只的荷瘤小鼠分为5组，其由对照组(4只小鼠，对照)、G-CSF施用组(5只小鼠，PEG-G-CSF)、吉西他滨施用组(5只小鼠，吉西他滨)、G-CSF与吉西他滨共同施用组(5只小鼠，Gem PEG)和EC-18共同施用组(5只小鼠，Gem PEG EC-18)组成，如表1和图1A所示。表1.小鼠施用分组组别n吉西他滨PEG-G-CSFEC-18对照组4---PEG-G-CSF53微克-吉西他滨510毫克/公斤--Gem PEG510毫克/公斤3微克-Gem PEG EC-18510毫克/公斤3微克50毫克/公斤在第8天，牺牲所有小鼠并移除它们的肿瘤。测量肿瘤的大小和重量。结果于表2和表3所示，肿瘤照片见于图1C。表2.肿瘤重量表3.肿瘤重量增加( )或减少(-)的％数据显示，与对照组相比，用吉西他滨治疗小鼠的肿瘤重量减少约25％，证明吉西他滨治疗的抗癌效果。数据显示，施用G-CSF(Filgrastitn)的小鼠的肿瘤重量与对照组相比增加约19.4％，显示G-CSF促进肿瘤生长的副作用。数据表明，在联合施用吉西他滨和G-CSF的小鼠中，与对照组相比，未观察到肿瘤重量的变化，这表明不论对嗜中性粒细胞低下症的治疗效果，联合施用G-CSF降低化疗的疗效。数据表明，EC-18与吉西他滨和G-CSF的共同施用显著减少高达41％的肿瘤重量，这比仅施用吉西他滨所降低的更多。结果与肿瘤重量相对于荷瘤小鼠体重的百分比变化(表3)和肿瘤组织照片(图1C)一致。数据说明EC-18(即PLAG或本申请的式2化合物)最小化G-CSF对肿瘤生长的副作用。实施例2：通过PLAG处理抑制TAN环境和G-CSF共同刺激中MDA-MB-231乳腺癌细胞的异常转移材料与方法细胞培养MDA-MB-231和HL60细胞取自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)。MDA-MB-231细胞在含有10％的胎牛血清(HyClone，Waltham，MA，USA)，1％的抗生素(100mg/l链霉素，100U/ml青霉素)和0.4％的2-巯基乙醇(SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)的DMEM培养基(WELGENE，Seoul，Korea)中生长。HL60细胞在含有10％的胎牛血清和1％的抗生素(100mg/l链霉素，100U/ml青霉素)的DMEM培养基中生长。细胞在37℃，5％CO2的气氛中生长。为了将HL60细胞分化成嗜中性粒样细胞，细胞在含有10％DMSO(SigmaAldrich)的培养基中生长5天。伤口愈合测定MDA-MB-231种于有盖玻片的12孔盘中，并在孔中培养至100％群集(confluence)。培养后，使单层伤口细胞在孔的中心。经处理的PLAG于指示的时间和嗜中性粒细胞和G-CSF共刺激。在37℃，5％CO2的气氛中按指定时间和剂量处理后，细胞用3.7％甲醛固定20分钟，然后用0.2％TritonX-100渗透20分钟，然后用0.1％Phalloidin-FITC染色40分钟。透过共聚焦(CarlZeiss，Thornwood，NY，USA)检测萤光。共聚焦(免疫萤光)MDA-MB-231种于有盖玻片的12孔盘中，并在孔中培养至60％汇合。培养后，于指定时间经PLAG处理和嗜中性粒细胞和G-CS共同刺激。在37℃，5％CO2的气氛中于指定时间处理后，将细胞用3.7％甲醛固定20分钟，然后用0.2％TritonX-100渗透20分钟，然后用0.1％Phalloidin-FITC染色40分钟。细胞用PBS洗涤2次并与特异性抗体于4℃反应过夜。细胞由PBS洗涤两次并与二抗反应。于细胞核检测，用1％Hoechst33342染色20分钟。通过共聚焦(CarlZeiss，Thornwood，NY，USA)检测萤光。细胞侵入试验(Transwellinvasionassay)使用改良的博伊登室(Boydenchamber)(SPLlifescience，Seoul，Korea)进行定量巨噬细胞化学引诱试验，在24孔盘中具有基质胶(matri-gel)涂覆，镶嵌于8.0μm孔的聚碳酸酯膜。下室充满用于化学引诱的凋亡嗜中性粒细胞。将于无血清培养基中的MDA-MB-231细胞(5×104细胞/ml)加入上室并用PLAG处理。在37℃，5％CO2的气氛中于指定时间使细胞进行化学引诱(嗜中性粒细胞共培养上清液)。用棉花棒刮去膜上表面的未引诱细胞，并用MTT检测法计算趋化细胞数。结果于离体(exvivo)环境使用transwell证实PLAG于TAN(肿瘤相关嗜中性粒细胞)环境识别乳腺癌细胞中MDA-MB-231异常转移的抑制作用的效果。结果证实，嗜中性粒细胞刺激的MDA-MB-231细胞的移动力被诱导，而PLAG处理导致移动力降低。此外，我们使用培养液证实MDA-MB-231乳腺癌细胞的transwell侵入作用，表明嗜中性粒细胞刺激培养液中的侵入增加，而PLAG治疗组中癌细胞的侵入减少。另一方面，G-CSF和嗜中性粒细胞共同刺激比只有嗜中性粒细胞组更能增加癌细胞的转移。在共刺激组中，transwell侵入以及癌细胞的移动率进一步增加，而PLAG处理组与嗜中性粒细胞刺激组以相同的方式抑制癌细胞的异常转移。表4：第3B图的原始数据。侵入性细胞计数(MTT测定，％转化)实施例3:PLAG处理对在TAN环境和G-CSF共刺激中，EMT标记表达的抑制材料和方法细胞培养MDA-MB-231和HL60细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)。MDA-MB-231细胞在含有10％的胎牛血清(HyClone，Waltham，MA，USA)，1％的抗生素(100mg/l链霉素，100U/ml青霉素)的DMEM培养基(WELGENE，Seoul，Korea)中生长，和0.4％的2-巯基乙醇(SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)。HL60细胞在含有10％的胎牛血清和1％的抗生素(100mg/l链霉素，100U/ml青霉素)的DMEM培养基中生长。细胞在37℃的5％CO2的气氛中生长。为了将HL60细胞分化为嗜中性粒样细胞，细胞在含有10％DMSO(SigmaAldrich)的培养基中生长5天。聚合酶连锁反应(PCR)根据制造商的说明使用RiboEx(GeneAllbiotechnology，Seoul，Korea)提取全部的RNA，并根据制造商的说明使用ReverseAidscDNA合成试剂盒(ThermoScientific，Waltham，MA，USA)生成cDNA。PCR使用以下温度情况(profile)进行：95℃下进行10分钟的预变性(pre-denature)步骤，然后是95℃30秒，退火温度30秒和72℃30秒的35个循环，并且最终暴露于72℃保持10分钟。用于扩增的特定引子序列见表5。表5：目的基因扩增引物序列结果进行PCR以确认MDA-MB-231乳腺癌细胞通过PLAG处理与TAN环境和G-CSF刺激下对EMT标记表达的抑制作用。结果，作为EMT(上皮间质转化)标记的SNAIL和NCAD，波形蛋白的表达水平在嗜中性粒细胞和G-CSF共刺激组中增加，而表达水平通过PLAG处理降低。表6：(图4B-4D)的原始数据：PCR亮带强度(相对强度)实施例4：通过PLAG处理对TAN环境中细胞因子分泌和G-CSF共刺激的变化材料和方法细胞培养MDA-MB-231和HL60细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)。MDA-MB-231细胞在含有10％的胎牛血清(HyClone，Waltham，MA，USA)，1％的抗生素(100mg/l链霉素，100U/ml青霉素)和0.4％的2-巯基乙醇(SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)的DMEM培养基(WELGENE，Seoul，Korea)中生长。HL60细胞在含有10％的胎牛血清和1％的抗生素(100mg/l链霉素，100U/mlU/ml青霉素)的DMEM培养基中生长。细胞在37℃，5％CO2的气氛中生长。为了将HL60细胞分化为嗜中性粒样细胞，细胞在含有10％DMSO(SigmaAldrich)的培养基中生长5天。ELISA根据制造商的方案，使用专门针对来自BDBioscience的细胞因子的酶联免疫吸附测定(ELISA)分析细胞上清液或血浆中细胞因子的分泌水平。使用EMaxEndpointELISA酶标仪(MolecularDevicesCorporation，Sunnyvale，CA，USA)测量在450nm处的吸光度。结果TGF-β的分泌水平是于TAN环境和G-CSF共刺激的癌细胞转移活性标记，通过ELISA确认。结果，在TAN环境和G-CSF共刺激中，TGF-β的分泌水平增加。然而，已证实经PLAG处理后TGF-β的表达没有显著降低。于PLAG处理下抗癌细胞因子IFN-γ的分泌显著增加，而它没有改变TGF-β的分泌。相比之下，于G-CSF共刺激组中IFN-γ的分泌显著低于仅有嗜中性粒细胞组。表7：图5A的原始数据来自TGF-βELISA(450nmOD)表8：图5B的原始数据来自IFN-γELISA(450nmOD)实施例5：通过PLAG治疗对TGF-β依赖性癌细胞转移信号通路的抑制材料和方法细胞培养MDA-MB-231和HL60细胞获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD，USA)。MDA-MB-231细胞在含有10％的胎牛血清(HyClone，Waltham，MA，USA)，1％的抗生素(100mg/l链霉素，100U/ml青霉素)和0.4％的2-巯基乙醇(SigmaAldrich，St.Louis，MO，USA)的DMEM培养基(WELGENE，Seoul，Korea)中生长。HL60细胞在含有10％的胎牛血清和1％的抗生素(100mg/l链霉素，100U/ml青霉素)的DMEM培养基中生长。细胞在37℃，5％CO2的气氛中生长。为了将HL60细胞分化成嗜中性粒样细胞，细胞在含有10％DMSO(SigmaAldrich)的培养基中生长5天。免疫沉淀(IP)用PLAG处理的MDA-MB-231细胞在37℃，5％CO2的气氛中刺激以不同时间诱导嗜中性粒细胞和G-CSF共刺激，使用冰冷的IP裂解缓冲液(25mMTris-HClpH7.4，150mMNaCl，1％NP-40，1mMEDTA，5％甘油)溶解。提取的蛋白质与SurebeadsProteinG特异性抗体结合磁珠(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)一起培养。用含Tween20(PBST)的PBS洗涤珠子，用1x样品缓冲液洗涤靶蛋白，并通过西方墨点法分析。共聚焦(免疫萤光)MDA-MB-231细胞于带盖玻片的12孔盘中培养，并在孔中培养至60％群集。培养后，于指示时间进行PLAG处理和嗜中性粒细胞和G-CSF共同刺激。在37℃，5％CO2的气氛中于指定时间处理后，细胞用3.7％甲醛固定20分钟，然后用0.2％TritonX-100渗透20分钟以进行染色。细胞用PBST洗涤2次，与特异性抗体(SMAD2/3)于4℃下反应过夜。细胞用PBST洗涤两次并与二抗反应。于细胞核检测，用1％Hoechst33342染色20分钟。通过共聚焦(CarlZeiss，Thornwood，NY，USA)检测萤光。结果在TAN环境中通过PLAG处理证实TGF-β依赖性信号通路对癌细胞转移的抑制作用。结果证实，通过PLAG处理降低SMAD活性的增加，SMAD活性是TAN和G-CSF共刺激提升的TGF-β信号通路。此外，我们证实用于细胞核易位的SMAD2/3-SMAD4复合物的形成随着PLAG处理而减少。我们证实TAN提升SMAD2/3和SMAD4的核易位，G-CSF共刺激随着PLAG治疗而减少。应当了解本文描述的示例和实施例仅用于说明目的，并且将向本领域技术人员建议根据其进行的各种修改或改变，以及将被包括在本申请的精神和范围内以及本专利申请范围的附加项内。在此引用的所有出版物，专利和专利申请出于所有目的通过引用全文的方式并入本文。序列表<110>ENZYCHEM生命科学株式会社(EnzychemLifesciencesCorporation)<120>治疗癌症的方法和组合物<130>055312-578F01WO<160>8<170>PatentInversion3.5<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>1gacaatgcccctcaagtgtt20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400>2ccattaagccgagtgatggt20<210>3<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>3gagaactttgccgttgaag19<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400>4tccagcagcttcctgtaggt20<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>5ccccaatcggaagcctaact20<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400>6acagagtcccagatgagca19<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>正向引物<400>7caaggtcatccatgacaactttg23<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>反向引物<400>8gtccaccaccctgttgctgtag22当前第1页12