精氨酸/赖氨酸多肽在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途的制作方法

1.本发明属于活性多肽技术领域，具体涉及精氨酸/赖氨酸多肽在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途。


背景技术：

2.人体皮肤可分为表皮、真皮和皮下组织三层，其中真皮主要由成纤维细胞和细胞外基质组成。在细胞外基质中存在着各种不同的胶原蛋白(如i型、ii型和iii型等)、弹性蛋白、非胶原糖蛋白、蛋白聚糖与氨基聚糖等，它们可以维持皮肤的机械强度、弹性和正常的生理功能。其中，胶原蛋白占细胞外基质中所有蛋白的70％，是细胞外基质的主要成分。此外，在基底膜和真皮
‑
表皮连接处分别存在iv型胶原蛋白以及vi和vii型胶原蛋白，能够使皮肤具有紧致性和抗压性。皮肤中胶原蛋白的含量及分布决定了皮肤的年轻与否，当胶原蛋白含量异常减少时，真皮层会变薄，皮肤开始变得松弛和失去弹性，出现皱纹。
3.随着年龄的增长，皮肤的新陈代谢开始变得缓慢，皮肤中胶原蛋白生成减少，胶原纤维结构也发生变化，皮肤逐渐失去弹性，变得松弛。此外，一些外源性因素如紫外线辐射、空气环境污染或日常压力等也会加快皮肤老化，导致皮肤屏障受损、肤色暗沉、肤质粗糙以及皮肤的弹性和紧致性减弱。
4.对此，人们提出了许多方法来对抗衰老，如激活细胞再生、增加细胞外基质(胶原蛋白和弹性蛋白等)、保护机体免受紫外辐射或环境污染等。胶原蛋白是细胞外基质的主要成分，因此，科研人员对模仿胶原蛋白活性的肽序列进行了广泛研究。例如棕榈酰五肽
‑
4是前胶原蛋白α1的水解产物，通过与特定受体相互作用调节细胞活性，激活参与细胞外基质更新和细胞增殖过程的某些基因，促进ⅰ和ⅲ型胶原蛋白、纤维粘连蛋白的生成，从而增加皮肤厚度及减少细纹。棕榈酰四肽
‑
7可以抑制一些不必要和不恰当的炎症反应与糖基化损伤，刺激层黏连蛋白v和胶原蛋白生成，从而增加皮肤弹性和紧致度，阻止皮肤形成皱纹和出现松弛。
5.最近研究表明，角质形成细胞在真皮
‑
表皮连接处的黏附在治疗皮肤老化中具有重要作用。通过增加它们之间的细胞黏附和细胞
‑
细胞外基质黏附，可以防止甚至治疗皮肤松弛。然而，目前关于细胞黏附在增加皮肤弹性，防止皮肤松弛，对抗老化方面的研究还很少。因此，有必要对具有促进皮肤细胞黏附作用的多肽序列进行研究。
6.据报道，精氨酸/赖氨酸多肽可以靶向多种电压敏感性钠通道(vssc)，可用于治疗或预防疼痛和局部麻醉。专利申请wo2013/153236描述了精氨酸/赖氨酸多肽主要阻断nav1.4通道，用于化妆品领域消除人面部细纹或皱纹。迄今为止，在现有技术中从未描述过精氨酸/赖氨酸多肽对皮肤细胞之间的黏附有影响。


技术实现要素：

7.本发明人通过大量实验研究，结果以令人惊讶和出乎意料的方式发现，精氨酸/赖
氨酸多肽对皮肤细胞之间的黏附有影响，可以提高细胞黏附能力，增加皮肤弹性，提高皮肤紧致度。
8.因此，本发明旨在提供一种精氨酸/赖氨酸多肽或其盐在制备用于皮肤修复紧致的组合物中的新用途。所述皮肤修复紧致包括提高细胞黏附能力、增加皮肤弹性或提高皮肤紧致度中的一种或几种。
9.术语“细胞黏附”一方面是指细胞与细胞外基质之间的黏附，另一方面是指细胞之间的细胞黏附。术语“皮肤细胞之间的黏附”，一方面是指皮肤细胞与细胞外基质之间的黏附，另一方面是指皮肤细胞之间的黏附。
10.皮肤细胞黏附能力的增加可以表明整联蛋白表达的增加。整联蛋白普遍存在于脊椎动物细胞表面，参与角质形成细胞与细胞外基质的黏附、细胞之间的连接以及皮肤的基底膜内聚力，对细胞黏附具有至关重要的影响。整联蛋白与胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或弹性蛋白等细胞外基质的各种分子相互作用，如基底角质形成细胞的整联蛋白与层粘连蛋白
‑
5相互作用，从而允许将细胞锚定在真皮
‑
表皮连接的二维网络上。此外，细胞黏附的增强可以保护胶原纤维的结构并对抗由于老化，特别是光致老化引起的皮肤萎缩。
11.可选地，所述精氨酸/赖氨酸多肽的序列是pglu
‑
gly
‑
cys
‑
cys
‑
asn
‑
gly
‑
pro
‑
lys
‑
gly
‑
cys
‑
ser
‑
ser
‑
lys
‑
trp
‑
cys
‑
arg
‑
asp
‑
his
‑
ala
‑
arg
‑
cys
‑
cys
‑
nh2。
12.可选地，所述精氨酸/赖氨酸多肽具有3对二硫键，所述二硫键位于cys3
‑
cys15、cys4
‑
cys21和cys10
‑
cys22位置。
13.所述精氨酸/赖氨酸多肽具有以下结构序列(即肽a)：
[0014][0015]
本发明中所使用的氨基酸缩写遵循iupac
‑
iub的生物化学命名委员会在eur j.biochem.(1984)138：9
‑
37和j.chem(1989)264：633
‑
673中指定的规则。
[0016]
本发明的这些肽可以作为立体异构体或立体异构体的混合物存在；例如，包含它们的这些氨基酸可以具有l
‑
、d
‑
的构型、或彼此独立地是外消旋的。因此，有可能获得同分异构混合物以及外消旋混合物或非对映混合物、或纯的非对映异构体或对映异构体，这取决于不对称碳的数量和存在什么同分异构体或同分异构混合物。本发明的这些肽的优选的结构是纯的同分异构体，即，对映异构体或非对映异构体。
[0017]
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.0001％
‑
5％的精氨酸/赖氨酸多肽或其盐；
[0018]
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.0005％
‑
1％的精氨酸/赖氨酸多肽或其盐；
[0019]
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.001％
‑
0.1％的精氨酸/赖氨酸多肽或其盐；
[0020]
可选地，所述组合物包含质量百分浓度为0.005％
‑
0.01％的精氨酸/赖氨酸多肽或其盐。
[0021]
本发明所述精氨酸/赖氨酸多肽或其盐，能够提高细胞黏附能力、增加皮肤弹性或提高皮肤紧致度。
[0022]
所述精氨酸/赖氨酸多肽的盐包括精氨酸/赖氨酸多肽的金属盐，所述金属包括：锂、钠、钾、钙、镁、锰、铜、锌或铝；
[0023]
可选地，所述精氨酸/赖氨酸多肽的盐包括精氨酸/赖氨酸多肽与有机碱形成的盐，所述有机碱包括：乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、组氨酸或哌嗪；
[0024]
可选地，所述精氨酸/赖氨酸多肽的盐包括精氨酸/赖氨酸多肽与无机酸或有机酸形成的盐，所述有机酸包括：乙酸、柠檬酸、乳酸、丙二酸、马来酸、酒石酸、延胡索酸、苯甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、琥珀酸、油酸、三氟乙酸、草酸、扑酸或葡萄糖酸；
[0025]
可选地，所述无机酸包括：盐酸、硫酸、硼酸或碳酸。
[0026]
所述精氨酸/赖氨酸多肽或其盐，可以使用在肽化学领域中本身已知的方法来完整地获得，例如固相合成法、液相合成法或固相与液相结合的方法，还可以通过以产生所希望的序列为目标的生物技术方法、或通过具有动物、真菌、或植物来源的蛋白质的控制水解来制备。
[0027]
例如，一种获得精氨酸/赖氨酸多肽的方法包括以下步骤：
[0028]
‑
将具有受保护的n
‑
末端和自由的c
‑
末端的氨基酸与具有自由的n
‑
末端和受保护的或与固体载体结合的c
‑
末端的氨基酸偶联；
[0029]
‑
消除保护n
‑
末端的基团；
[0030]
‑
重复该偶联顺序和消除保护n
‑
末端的基团，直到获得所希望的肽序列；
[0031]
‑
消除保护c
‑
末端的基团或从该固体载体裂解。
[0032]
优选地，c
‑
末端与一种固体载体结合并且该方法是在固相上进行，包括将具有受保护的n
‑
末端和自由的c
‑
末端的氨基酸与具有自由的n
‑
末端和与一种聚合物载体结合的c
‑
末端的氨基酸偶联；消除保护n
‑
末端的基团；并且重复此顺序所需要的次数以便因此获得具有所希望的长度的肽，接着从最初的聚合物载体裂解所合成的肽。
[0033]
在整个合成中这些氨基酸的侧链的官能团用临时或永久的保护基团保持充分地保护，并且可以与从该聚合物载体裂解肽的过程同时地或正交地脱保护。
[0034]
所述精氨酸/赖氨酸多肽或其盐，可以掺入到美容上或药学上可接受的递送系统或缓释系统中。
[0035]
术语“递送系统”是指与本发明的肽一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载体，它们选自：水、油或表面活性剂、包括石油来源、动物来源、植物来源、或合成来源的那些，例如并且不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、蓖麻油、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、醚硫酸酯、硫酸酯、甜菜碱、葡萄糖苷、麦芽糖苷、脂肪醇、壬苯醇醚、泊洛沙姆、聚氧乙烯、聚乙二醇、右旋糖、甘油、毛地黄皂苷和类似物。本领域的普通技术人员已知在可以给予本发明的肽的不同递送系统中可以使用的稀释剂。
[0036]
术语“缓释”以常规含义使用，指提供化合物在一段时间内逐渐释放的化合物的递送系统，且优选地但不是必须地，在整个时间段内具有相对恒定的化合物释放水平。
[0037]
递送系统或缓释系统的实例是脂质体、油质体、非离子型表面活性剂脂质体囊泡、醇质体、毫米胶囊、微米胶囊、纳米胶囊、纳米结构的脂质载体、海绵状物、环糊精、类脂囊泡、胶束、毫米球、微米球、纳米球、脂质球、微米乳液、纳米乳液、毫米粒子、微米粒子或纳米粒子。优选的递送系统或缓释系统是脂质体和微米乳液，更优选具有反胶束的内部结构的
油包水型微米乳液。
[0038]
缓释系统可以通过现有技术中已知的方法来制备，并且可以例如通过以下方式来给予：通过局部或经皮给药，包括粘附贴剂、非粘附贴剂、封闭贴剂、以及微电子贴剂；或通过全身给药例如并且不局限于，口服或胃肠外途径，包括鼻、直肠、皮下植入或注射、或直接植入或注射至特定身体部位中，并且优选地应该释放相对恒定量的本发明的这些肽。在该缓释系统中包含的肽的量将取决于例如该组合物将被给予的部位、本发明的肽的释放动力学和持续时间、以及有待治疗和/或护理的病状、病症和/或疾病的性质。
[0039]
所述精氨酸/赖氨酸多肽或其盐，还可以吸附在固体有机聚合物或固体无机支撑体上，例如并且不局限于，滑石、膨润土、二氧化硅、淀粉、或麦芽糖糊精等。
[0040]
本发明所述组合物是美容组合物或药物组合物。
[0041]
所述组合物存在于一种制剂中，选自：霜剂、油、奶、香膏、泡沫、洗剂、凝胶、擦剂、浆液、皂、洗发精、润发乳、血清、软膏、摩丝、润发油、粉末、杆剂、笔剂、喷雾剂、气溶胶、胶囊剂、片剂、颗粒剂、口香糖、溶液、混悬液、乳剂、糖浆剂、酏剂、多糖薄膜、胶冻或明胶。
[0042]
本发明所述组合物还包含至少一种用于增强本发明所述皮肤修复紧致的作用的其他活性剂，所述其他活性剂选自肽类、天然植物成分、维生素c及其衍生物或类视黄醇类。
[0043]
本发明相对于现有技术所取得的有益效果包括：
[0044]
本发明所述精氨酸/赖氨酸多肽或其盐，在现有技术中从未描述过它们对皮肤细胞之间的黏附有影响。本发明人通过大量实验研究，结果以令人惊讶和出乎意料的方式发现，精氨酸/赖氨酸多肽或其盐可以提高细胞黏附能力，通过增加皮肤细胞之间的黏附和细胞
‑
细胞外基质黏附，可以防止甚至治疗皮肤松弛，增加皮肤弹性，提高皮肤紧致度，从而具有良好的皮肤修复紧致效果，能够应用于皮肤修复紧致的产品中。
附图说明
[0045]
图1是肽a对hacat细胞活性的影响结果图。***表示与空白对照组相比差异极为显著，p<0.001(n＝4)。
[0046]
图2是肽a对nih3t3细胞活性的影响结果图。***表示与空白对照组相比差异极为显著，p<0.001(n＝4)。
[0047]
图3是肽a对hacat细胞黏附能力影响结果图。*表示给药组与空白对照组相比具有统计学差异，p<0.05(n＝8)。**表示给药组与空白对照组相比差异显著，p<0.01(n＝8)。
[0048]
图4是实施例5对面部皮肤弹性改善作用成像图。
[0049]
图5是实施例5对面部皮肤弹性改善的测试结果图。
具体实施方式
[0050]
为了更好地理解本发明，下面结合实施例及附图对发明作详细的说明，然而，应当理解的是，这些实施例及附图仅用作说明目的，并且不旨在限制本发明的范围。
[0051]
实施例1细胞活性实验
[0052]
1.1试剂与材料
[0053]
胎牛血清(gibco)、dmem培养基(gibco)、青霉素、链霉素、mtt(sigma)。
[0054]
1.2仪器
[0055]
酶标仪(美国md)、co2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
[0056]
1.3细胞株
[0057]
人角质形成细胞(hacat)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库，小鼠皮肤成纤维细胞(nih3t3)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会上海细胞库。
[0058]
1.4待测样品
[0059]
给药组：0.1ppm肽a、1ppm肽a、10ppm肽a、50ppm肽a、100ppm肽a、500ppm肽a、1000ppm肽a；
[0060]
对照组：pbs空白对照、2％dmso阳性对照。
[0061]
1.5实验目的
[0062]
本实验的目的是通过以nih3t3成纤维细胞和hacat角质形成细胞作为实验对象，评价给药后72h的细胞活性，确定本发明的肽对细胞活性的影响。
[0063]
1.6实验方法
[0064]
取冻存的nih3t3和hacat细胞培养，按照1：2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。
[0065]
将细胞2000个/孔接种在96孔板中，待细胞贴壁后，按照倍比稀释法，分别加入给药组和对照组样品，补充培养基至200μl，置于37℃、5％co2培养箱中孵育72h。
[0066]
之后每孔加入22μl 5mg/ml mtt，继续于37℃、5％co2培养箱中孵育4h。弃去原溶液，加入150μl/孔的dmso。5min后使用酶标仪读取490nm和630nm波长下的参比od值。
[0067]
1.7结果
[0068]
mtt法是一种检测细胞存活和生长的方法，测得的od值与细胞活性成正比。
[0069]
图1为肽a作用于hacat细胞的检测结果，结果显示，在2％dmso的作用下，阳性对照组的细胞活性大为下降，与空白对照组相比差异极为显著。相比之下，0
‑
1000ppm范围内各剂量的肽a均无明显hacat细胞毒性。
[0070]
图2为肽a作用于nih3t3细胞的检测结果，结果显示，在2％dmso的作用下，阳性对照组的细胞活性大为下降，与空白对照组相比差异极为显著。相比之下，0
‑
1000ppm范围内各剂量的肽a均无明显nih3t3细胞毒性。
[0071]
因此，本发明所述的精氨酸/赖氨酸多肽在1000ppm范围内对角质形成细胞和成纤维细胞均无明显毒性。
[0072]
实施例2细胞黏附实验
[0073]
2.1试剂与材料
[0074]
胎牛血清(gibco)、dmem培养基(gibco)、青霉素、链霉素、mtt(sigma)。
[0075]
2.2仪器
[0076]
酶标仪(美国md)、co2培养箱(上海一恒)、超净工作台(苏州净化)。
[0077]
2.3细胞株
[0078]
人角质形成细胞(hacat)购买自中国科学院典型培养物保藏委员会昆明细胞库。
[0079]
2.4待测样品
[0080]
给药组：0.1ppm肽a、1ppm肽a、10ppm肽a、50ppm肽a、100ppm肽a；
[0081]
对照组：pbs空白对照。
[0082]
2.5实验目的
[0083]
通过选择hacat角质形成细胞，铺板在药物包被好的96孔板中，孵育且经一段外力作用后，评价药物对细胞黏附的影响，以此确定本发明的肽能否改善细胞弹性。
[0084]
2.6实验方法
[0085]
取冻存的hacat细胞培养，按照1：2传代至5代左右，选择长势较好的细胞作为实验对象。
[0086]
将待测样品按照20μl/孔加入至96孔板中，37℃恒温烘箱干燥过夜。于第二天将长势较好的hacat细胞消化后，以hacat细胞1万/孔密度种板，并将培养基补至200μl，于37℃、5％co2培养箱中孵育3h。培养结束后，将培养板取出并继续补充培养基至液面刚好溢出，用封口膜封闭，以保证没有气泡。顺时针翻转20min。弃去原有培养基，每孔加入90μl新鲜培养基和10μl 5mg/ml的mtt，置于37℃、5％co2培养箱中孵育3h。弃去溶液，加入150μl的dmso。使用酶标仪读取490nm和630nm波长下的参比od值。
[0087]
2.7结果
[0088]
细胞黏附实验通过评价细胞的黏附能力来反应细胞的弹性。在经过三维力作用之后，黏附性强的细胞能保持在96孔板上，通过对板上活细胞进行mtt定量分析，即可反映细胞的黏附作用。保持在96孔板上的活细胞越多，测得的od值越大，表明包被的药物促进细胞黏附的作用越强，进一步表明药物增加细胞弹性的作用越大。
[0089]
图3为肽a对hacat细胞黏附能力的影响结果图。结果显示，1ppm
‑
100ppm浓度的肽a均能够明显提高细胞黏附能力，与空白对照组相比具有统计学差异。其中，50ppm的肽a促进细胞黏附的作用更加明显，与空白对照组相比差异显著。
[0090]
以上表明，本发明的精氨酸/赖氨酸多肽能促进hacat细胞的黏附能力，从而有利于提高其弹性。
[0091]
实施例3含肽a的脂质体的制备
[0092][0093]
将磷脂酰胆碱称重且溶于氯仿。于真空下蒸发溶剂，直至得到磷脂薄层，将此层于55℃以所需浓度的肽水溶液处理而水化，得到多室脂质体。将多室脂质体通过高压均质处理，得到尺寸更加小而均一的单室脂质体。
[0094]
实施例4含肽a的微米乳液组合物的制备
[0095][0096]
按照处方用量，称取b相的成分加于容器中。接着，将d相添加至b相且于连续搅拌下均质化。随后将a相添加至混合物。最后，添加c相，得到含肽a的微米乳液组合物。
[0097]
实施例5含肽a的精华液的制备
[0098][0099]
按照处方量，称取甘油、丁二醇、透明质酸在合适容器内预先混合均匀；将水加入配料锅，开启搅拌，加热至80℃
‑
85℃，保温30min；将配料锅降温至65℃左右，加入戊二醇、己二醇，搅拌10min至均匀；继续降温至40℃左右，依次加入处方量的甜菜碱、肽a，搅拌20
‑
30min，分散完全即得。
[0100]
对比例1不含肽a的精华液的制备
[0101][0102]
按照处方量，称取甘油、丁二醇、透明质酸在合适容器内预先混合均匀；将水加入配料锅，开启搅拌，加热至80℃
‑
85℃，保温30min；将配料锅降温至65℃左右，加入戊二醇、己二醇，搅拌10min至均匀；继续降温至40℃左右，加入处方量的甜菜碱，搅拌20
‑
30min，分散完全即得。
[0103]
实施例6增加皮肤弹性的功能测试
[0104]
6.1受试者
[0105]
20名30
‑
50岁的受试者，性别不限。
[0106]
6.2待测样品
[0107]
以实施例5作为待测样品，并于使用样品前和使用样品15min后，拍照观察及检测面部皮肤弹性的改善效果。
[0108]
6.3测试仪器
[0109]
皮肤弹性测试仪mpa580(德国ck)。
[0110]
6.4目的
[0111]
皮肤弹性越好，抽吸皮肤后再放松，其回弹值越大，抽吸阶段跟放松阶段的落差越大。通过测试受试者在使用样品前后的面部皮肤弹性，以评价本发明的肽对弹性的改善作用。
[0112]
6.5方法
[0113]
受试者使用实施例5对其面部进行涂敷，时间为15min，并于使用前及使用15min后，对受试者面部皮肤进行拍照及使用皮肤弹性测试仪对面部皮肤弹性进行测试。
[0114]
进行弹性测试时，抽吸皮肤3s(suction phase)，再放松回弹3s(relaxation phase)，监测整个过程的皮肤状态变化。
[0115]
6.6结果
[0116]
实施例5样品对面部皮肤弹性改善作用成像图及测试结果图分别见图4、图5。
[0117]
图4结果显示，相对于实施例5样品使用前，受试者在使用样品15min后，面部粗糙感与侧面垂感消失，皮肤更加紧致饱满，细腻有光泽。
[0118]
图5皮肤弹性测试结果显示，相对于使用样品前，使用实施例5样品15min后，抽吸阶段跟放松阶段的落差更大，表明皮肤的回弹值更大，皮肤弹性提高。
[0119]
由此说明，本发明的精氨酸/赖氨酸多肽能够提高角质形成细胞的黏附能力，从源头改善肤质，在0.00125％的低用量之下，在作用15min后，可以明显增加面部皮肤的弹性，提高皮肤紧致度，因此具有良好的皮肤修复紧致效果，能够应用于皮肤修复紧致的产品中。
[0120]
实施例7面部紧致功效测试
[0121]
7.1受试者
[0122]
40名30
‑
50岁的女性受试者。
[0123]
7.2待测样品
[0124]
以实施例5作为待测样品，对比例1作为安慰剂。
[0125]
7.3测试仪器
[0126]
visia面部图像分析仪(美国)。
[0127]
7.4目的
[0128]
通过测试受试者在使用样品前后的下巴宽度变化情况，以评价本发明的肽对面部的紧致效果。
[0129]
7.5方法
[0130]
将40名受试者随机分为两组，每组20人，使用实施例5、对比例1进行盲测。
[0131]
洁面后，使用visia面部图像分析仪测试拍照，作为0天数据。受试者使用待测样品对其面部进行涂敷，每天早晚各涂敷一次，连续使用4周，之后再对面部进行拍照。对比0天及使用4周的拍照数据，分析各组受试者在使用样品后的下巴宽度减小尺寸。
[0132]
7.6结果
[0133]
使用实施例5及对比例1样品4周后，两组受试者的下巴宽度减小尺寸平均值见下表1。
[0134]
表1实施例5及对比例1的面部紧致效果
[0135][0136]
表1结果显示，使用4周后，实施例5给药组受试者的下巴宽度明显减小，表明本发明的精氨酸/赖氨酸多肽能够提高皮肤细胞的黏附能力，具有优异的面部紧致功效，能够应用于皮肤修复紧致的产品中。
[0137]
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所做的进一步详细的说明，但是不表示本发明的具体实施是局限于这些说明。对于本发明所属领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或是替换，都应视为属于本发明的保护范围。