一种1-氨基环丙烷羧酸含量检测试剂盒及检测方法与流程

一种1
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氨基环丙烷羧酸含量检测试剂盒及检测方法
技术领域
1.本发明属于试剂盒技术领域，具体涉及一种1
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氨基环丙烷羧酸含量检测试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.乙烯是植物生长发育过程中具有重要调节作用的内源性激素之一，但是在植物生长发育的过程中难以检测气态乙烯的含量，但是作为乙烯生成的前体，1
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氨基环丙烷羧酸(acc)的含量可以用来指示植物体内的乙烯含量，1
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氨基环丙烷羧酸(acc)属于环状1
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氨基环丙烷羧酸中的一种，在梨及苹果果汁中普遍存在，许多植物组织都具有在氧的条件下是1
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氨基环丙烷羧酸(acc)分解为乙烯的活性，在确定了植物体内乙烯生物合成途径后，1
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氨基环丙烷羧酸(acc)的含量与植物体内的乙烯含量是一一对应的。因此可以通过测定1
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氨基环丙烷羧酸(acc)的含量，来间接检测植物体内的乙烯含量。
3.而植物体内1
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氨基环丙烷羧酸(acc)的含量较低，采用普通的比色方法很难检测出来，同时1
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氨基环丙烷羧酸本身不能发射荧光，又不具有紫外吸收的特性，因此1
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氨基环丙烷羧酸(acc)的检测也比较困难。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种1
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氨基环丙烷羧酸含量检测试剂盒及检测方法，以解决背景技术中提出的技术问题。
5.为了实现上述目的，本发明公开了一种1
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氨基环丙烷羧酸含量检测试剂盒，包括以下试剂：
6.试剂一，0.1mol/l盐酸溶液：取90μl浓盐酸加入10ml水，混匀；
7.试剂二，三乙胺乙腈溶液：取1.4ml三乙胺加入8.6ml乙腈，混匀；
8.试剂三，异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取25μl异硫氰酸苯酯加入2ml乙腈，混匀；
9.试剂四，正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸1mg，加入0.1mol/l盐酸水溶液1ml溶解，混匀。
10.本发明同时要求保护一种1
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氨基环丙烷羧酸含量的检测方法，使用上述的检测试剂盒，包括如下步骤：(1)1
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氨基环丙烷羧酸的提取；(2)1
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氨基环丙烷羧酸的衍生；(3)1
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氨基环丙烷羧酸含量的测定；(4)1
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氨基环丙烷羧酸含量的计算。
11.进一步地，步骤(1)中，采用试剂一对植物样本进行1
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氨基环丙烷羧酸的提取。
12.进一步地，步骤(2)中，采用异硫氰酸苯酯对步骤(1)中提取得到的1
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氨基环丙烷羧酸进行衍生，得到1
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氨基环丙烷羧酸衍生产物样本溶液。
13.进一步地，步骤(3)中，准备已知浓度的1
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氨基环丙烷羧酸标准品溶液，采用高效液相色谱仪分别对步骤(2)中得到1
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氨基环丙烷羧酸衍生产物样本溶液，以及1
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氨基环丙烷羧酸标准品溶液进行测试。
14.进一步地，步骤(3)中，高效液相色谱仪使用有流动相，流动相包括流动相a和流动
相b，所述流动相的制备方法为：称取7.6g无水乙酸钠，加水925ml，溶解后用冰醋酸调节ph至6.5，然后加入乙腈70ml，混匀，随后用0.45μm滤膜过滤。所述流动相b为80％乙腈水溶液。
15.进一步地，步骤(4)中，1
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氨基环丙烷羧酸含量的计算公式为：x＝(f1/f2)
·
c
·
(v/w)，其中，x代表植物样本中1
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氨基环丙烷羧酸含量；f1代表1
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氨基环丙烷羧酸衍生产物样本溶液中1
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氨基环丙烷羧酸峰面积/内标峰面积；f2代表1
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氨基环丙烷羧酸标准品溶液中1
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氨基环丙烷羧酸峰面积/内标峰面积；c代表对照组的标准品中1
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氨基环丙烷羧酸的浓度；v代表提取液的总体积；w代表植物样本的质量。
16.本发明中，1
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氨基环丙烷羧酸的紫外吸收信号弱，浓度低于一定程度时就没有紫外吸收信号，而将1
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氨基环丙烷羧酸进行异硫氰酸苯酯衍生反应后，可以检测到更低的浓度，检测灵敏度大大提高；同时1
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氨基环丙烷羧酸为极性物质，用高效液相洗脱能力差，进行衍生化反应后的产物，极性较好，用高效液相色谱法可以有效的洗脱分离，进行定性定量检测。目前还可以用邻苯二甲醛(opa)衍生，但是opa的衍生反应不易控制，重复性较差，衍生效果没有异硫氰酸苯酯好。
17.与现有技术相比，本发明的1
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氨基环丙烷羧酸含量检测试剂盒及检测方法具有如下优点：
18.(1)本发明通过异硫氰酸苯酯(pitc)对1
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氨基环丙烷羧酸衍生后，1
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氨基环丙烷羧酸的检测灵敏度大大提高，检测的最低下限可达ng级别；
19.(2)本发明通过利用高效液相色谱仪检测该指标，适用于各种植物类型的样本，适用性广；
20.(3)本发明设置高效液相色谱仪的自动进样，自动化较高，可以进行全天24小时不间断检测，检测效率高。
附图说明：
21.图1：苹果样品中1
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氨基环丙烷羧酸的色谱图；
22.图2：1
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氨基环丙烷羧酸标准液的色谱图。
具体实施方式
23.下面通过具体实施例进行详细阐述，说明本发明的技术方案。
24.实施例1
25.一种1
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氨基环丙烷羧酸含量检测试剂盒，包括以下试剂：
26.试剂一，0.1mol/l盐酸溶液：取90μl浓盐酸加入10ml水中，混匀；
27.试剂二，三乙胺乙腈溶液：取1.4ml三乙胺加入8.6ml乙腈中，混匀；
28.试剂三，异硫氰酸苯酯乙腈溶液：取25μl异硫氰酸苯酯加入2ml乙腈中，混匀；
29.试剂四，正亮氨酸内标溶液：称取正亮氨酸1mg，加入0.1mol/l盐酸水溶液1ml中溶解，混匀。
30.一种使用上述1
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氨基环丙烷羧酸含量检测试剂盒对1
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氨基环丙烷羧酸的含量进行检测的检测方法，包括如下步骤：
31.1、1
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氨基环丙烷羧酸的提取
32.(1)称取0.2g样品，加入1ml试剂一混合，研磨成浆，移入ep管中，超声30min，然后
放入离心机中在8000g的离心力下离心20min，取上清液；
33.(2)残渣用0.5ml试剂一复提一次，重复上述步骤(1)，合并两次上清液；
34.(3)将步骤(2)中合并后的上清液中加入等体积的20％(v/v)三氯乙酸溶液沉淀，静置10min，混合液经8000g离心20min；
35.(4)取步骤(3)中的上清液用膜孔为0.22μm的滤膜过滤，过滤后的上清液待衍生。
36.2、1
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氨基环丙烷羧酸的衍生
37.(1)取上述待衍生的上清液200μl以及已知浓度的1
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氨基环丙烷羧酸溶液200μl，分别置于1.5ml ep管中，分别记为测试组和对照组；
38.(2)往测试组和对照组的离心管中分别准确加入正亮氨酸内标溶液(试剂四)20μl；
39.(3)往测试组和对照组的离心管中分别加入三乙胺乙腈溶液(试剂二)200
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300μl，直至溶液的ph>7，以及异硫氰酸苯酯乙腈溶液(试剂三)100μl，混匀后25℃下放置1小时；
40.(4)然后往测试组和对照组的离心管中分别加入正己烷400μl，混合均匀后放置10min；
41.(5)取下层溶液，用0.45μm针式过滤器过滤，过滤后得上清液：测试组中的上清液为1
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氨基环丙烷羧酸衍生产物样本溶液，对照组中的上清液为1
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氨基环丙烷羧酸标准品溶液。
42.3、1
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氨基环丙烷羧酸含量的测定
43.首先配制流动相a：称取7.6g无水乙酸钠，加水925ml，溶解后用冰醋酸调节ph至6.5，然后加入乙腈70ml，混匀，随后用0.45μm滤膜过滤；以及流动相b：80％乙腈水溶液；
44.(1)开启电脑、检测器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10μl，流速1.0ml/min，柱温40℃，走样时间为45min，设置完毕保存方法组。
45.(2)首先用流动相a过柱子，待基线稳定后开始加样，然后按照梯度洗脱的方法进行色谱检测，梯度洗脱如表1所示：
46.表1不同测试时间点的流动相梯度洗脱表
[0047][0048]
(3)加入对照组中的1
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氨基环丙烷羧酸标准品溶液10μl，在30min内可分离1
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氨基环丙烷羧酸，出峰时间为14.137min左右(柱子不同，保留时间有差异)。
[0049]
(4)加入测试组中的1
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氨基环丙烷羧酸衍生产物样本溶液10μl，在相应保留时间处检测1
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氨基环丙烷羧酸的峰面积。
[0050]
测定过程中，为了避免使用过程中柱压变化过大，每一步的流速由小到大调节；使用完毕后，需用纯乙腈冲洗柱子30min，防止无机盐结晶堵塞色谱柱；在仪器操作过程中，要时刻注意柱压的变化，防止柱压过高，损害仪器。
[0051]
4、1
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氨基环丙烷羧酸含量的计算
[0052]
植物样本中1
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氨基环丙烷羧酸含量的计算公式为：x＝(f1/f2)
·
c
·
(v/w)，
[0053]
其中，x代表1
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氨基环丙烷羧酸含量；f1代表样本溶液中1
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氨基环丙烷羧酸峰面积/内标峰面积；f2代表标准品溶液中1
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氨基环丙烷羧酸峰面积/内标峰面积；c代表对照组的标准品中1
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氨基环丙烷羧酸浓度；v代表两次提取液的总体积，即1.5ml；w代表称取的植物样本质量，即0.2g。
[0054]
如图1为苹果样品中1
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氨基环丙烷羧酸衍生产物样本溶液的色谱图，图2为1
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氨基环丙烷羧酸标准品溶液的色谱图，为了更好地展示色谱图中1
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氨基环丙烷羧酸峰的细节，图1和图2仅给出了前15分钟左右的色谱图。
[0055]
已知对照组的1
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氨基环丙烷羧酸标准品溶液中1
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氨基环丙烷羧酸浓度为50ng/ml。
[0056]
在图1中，acc的出峰时间为14.1371min；在图2中acc的出峰时间为14.1771min，根据图1和图2中1
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氨基环丙烷羧酸的峰面积，代入上述植物样本中1
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氨基环丙烷羧酸含量的计算公式中，可得：
[0057]
x＝(f1/f2)
·
c
·
(v/w)＝(0.965/1.035)
·
50
·
(1.5/0.2)＝349.64ng/g。
[0058]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的设计构思之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。