一种对MDA单细胞全基因组扩增产物的质控方法与流程

一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法
【技术领域】
1.本发明属于基因工程技术领域，涉及一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法。


背景技术：

2.胚胎植入前遗传学检测技术(preimplatation genetic testing,pgt)，俗称“第三代试管婴儿技术”，是指在体外受精的胚胎移入子宫前，通过显微操作技术获取少量细胞，然后采用pcr、基因芯片(chromosomal microarray analysis,cma)或高通量测序技术(next
‑
generation sequencing,ngs)对其进行遗传学分析，以排除携带致病性遗传性疾病或染色体异常的胚胎，选择正常的胚胎移植入子宫的技术，从而阻断变异基因在家族中的传播，有效地防止遗传性出生缺失儿的出生。但是，基因芯片和ngs的检测需要大量的遗传物质，而pgt所获取的样本细胞一般只有1个卵裂球细胞或者囊胚期3
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7个滋养层细胞，遗传物质少，无法满足下游对基因病和染色体异常的检测需求。所以，需要在体外将这种特殊类型的样本细胞进行全基因组扩增，以获得大量高覆盖率的基因组，该方法即所谓的单细胞全基因组扩增技术(whole
‑
genome amplification,wga)。
3.wga技术根据方法原理不同，主要分为两种类型：一是基于热循环、以pcr为基础的扩增技术，如简并寡核苷酸引物pcr(dop
‑
pcr)、连接反应介导的pcr(lm
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pcr)、扩增前引物延伸反应(pep)以及多次退火环状循环扩增技术(malbac)等；另一种是基于等温反应、不以pcr为基础的扩增技术，如多重置换扩增(mda)和基于引物酶的全基因组扩增(pwga)。目前，扩增效率、基因组覆盖度以及扩增均一性较好，且广泛应用于临床的方法是mda和malbac。这两种wga的方法各有优缺点：1、mda可以扩增出较长的dna片段(2000bp以上)，但是其扩增基因组的均一性不太理想，即存在某些区域dna指数扩增的问题。mda扩增产物适合用于基于pcr(gap
‑
pcr)和基因芯片(snp单倍型分析)等技术对点突变和大片段缺失、重复的诊断，但对基因组拷贝数变异的检测效果较差；2、malbac扩增出来的产物可较均一的覆盖整个基因组，但是产物片段长度较短(约300
‑
700bp)，适合用于基于pcr和ngs等技术对点突变和染色体拷贝数变异的分析。因为基因芯片平台需要依赖于较长的dna片段，所以用基因芯片进行检测时，需要用mda进行扩增；ngs平台在建库时需要将基因组打断成300bp左右的片段，对基因组的长度要求不高，故malbac的扩增产物适合用ngs来检测。
4.目前，两种wga的方法和上述两种常用的遗传学分析方法(cma和ngs)暂时无法兼容使用，所以在临床工作中，需要根据不同的检测项目，采用不同的wga方法和遗传学检测方法，即mda cma或malbac ngs，两种wga方法的需求都比较大。特别是在广西壮族自治区，有较多的缺失型
ɑ
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地贫携带者，需要采用mda cma对胚胎携带缺失型
ɑ
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地贫的情况进行检测，以阻止中、重型地中海贫血患儿的出生。常用于pgt的芯片平台主要是illumina生产的humankaryomap
‑
12，该芯片对致病基因突变位点的上、下游snp位点进行连锁分析，可同时对胚胎携带致病突变基因的情况和4mb以上大小的染色体异常(缺失/重复)进行检测。但是，在进行染色体异常分析时，基因芯片技术对初始模板dna(即wga产物)的质量要求较高，
如果初始模板dna质量较差，检测结果则很难分辨出染色体的异常，特别是较小片段的缺失/重复。所以，在进行基因芯片分析之前，需要先对wga产物的片段长度、浓度、完整性和可扩增性等进行质控。目前，对mda扩增产物的质控方法主要依赖于琼脂糖凝胶电泳，通过电泳可以有效分析wga的扩增效率、产物片段长度和大致的dna含量等信息。但是无法确定其完整性和可扩增性，即无法判断wga产物是否可以作为模板dna用于下游的基因检测。以前，在没有更好的方法进行质控之前，只能进行电泳分析其片段长度和含量之后，直接进行基因芯片检测，但是基因芯片价格昂贵，如果wga产物不符合要求，将导致检测失败，造成极大的浪费和提高pgt技术成本。
5.因此，采用一种高效、简便易行、可靠的方法对mda产物的质量进行评估，可以有效提高下游遗传学检测的成功率和质量，降低临床检测成本和患者的经济负担。


技术实现要素：

6.针对现有技术对mda单细胞全基因组扩增(wga)产物的质控方法——琼脂糖凝胶电泳，无法确定产物dna片段的完整性和可扩增性，即无法判断产物是否可以作为模板dna用于下游的遗传学检测的问题，本发明提供了一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，是一种新的质控方法，该方法结合琼脂糖凝胶电泳分析，可快速、准确的分析wga的产物质量。
7.本发明的目的通过以下技术方案来实现：
8.一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，包含8对引物，分别扩增8个管家基因的相应dna片段，包括如下步骤：
9.1)所用的8对引物序列合成后，采用pag法纯化并冻干成粉末状保存、运输；
10.2)将8对引物分别用ddh2o稀释成100μmol/l的母液，再各取20μl上下游引物母液混合在一起并调整浓度至10μmol/l，制备成引物工作液；
11.3)吸取2μl wga产物和2μl引物工作液，采用hifi酶或者其它高效、高保真聚合酶进行pcr反应；
12.4)pcr反应结束后，取10μl产物并加入2μl 6
×
dna loading buffer混匀后，在2％琼脂糖凝胶上电泳，120v，35min，然后在凝胶成像仪上紫外光成像；如果模板dna质量较好，理论上可以扩增出8条产物；如果只有6个及以上扩增产物，则说明该模板dna可用于下游基因芯片检测，且条带越多、越清晰明亮，表明模板dna的质量越好，基因芯片的检测结果越理想；
13.所用的8对引物序列和扩增产物的片段长度如下所示：
[0014][0015]
本发明中：
[0016]
步骤1)所述的采用pag法纯化，是引物合成的一种纯化方式，可以获得纯度较高的引物，以提高pcr的效率和特异性。
[0017]
步骤3)所述的高效聚合酶，选自hifi高保真酶(transtaq dna polymerase)。
[0018]
步骤3)所述的进行pcr反应，反应体系和热循环条件如下：
[0019]
10
×
hifi buffer i 2.5μl dntp 2μl 2μl混合引物 0.5μl hifi polymerase dna溶液或wga产物3μl ddh2o 15μl，混均，总反应体积为25μl；94℃变性3min，94℃30s
→
61℃40s
→
72℃1min，循环35次，72℃延伸3min。
[0020]
和现有技术相比，本发明具有如下优点：
[0021]
1、本发明所述的一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，通过对mda的产物进行常规琼脂糖电泳分析其扩增效率和片段长度之后，再分析一组管家基因的扩增效率，以对wga产物的可扩增性进行进一步的分析，从而提高下游遗传学检测的成功率和检测结果的可靠性、准确性，降低因模板dna质量问题导致遗传学检测结果质控不合格造成的无效检测和经济损失。
[0022]
2、本发明所述的一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，简便易行，8对引物可以在同一个反应管内进行，从而减少添加试剂成分和分装的步骤，整个反应对实验室条件要求低，只需要有常规的pcr扩增实验室、琼脂糖电泳和凝胶分析仪。
【附图说明】
[0023]
图1是本发明实施例1中8对引物扩增后琼脂糖电泳结果图以及基因芯片分析结果的图(左图为以三个胚胎细胞样本经mda扩增后的产物为模板进行pcr反应的电泳结果，右图为基因芯片检测呈现的snp位点分布图(黑点)、染色体拷贝数拟合线(中间曲线)以及相应的call_ratio值(标注在图的上方))；
[0024]
图2是本发明实施例2中8对引物扩增后琼脂糖电泳结果图以及基因芯片分析结果图(左图为以四个胚胎细胞样本经mda扩增后的产物为模板进行pcr反应的电泳结果，右图为基因芯片检测呈现的snp位点分布图(黑点)、染色体拷贝数拟合线(中间曲线)以及相应的call_ratio值(标注在图的上方))；
[0025]
图3是本发明实施例3中8对引物扩增后琼脂糖电泳结果图以及基因芯片分析结果
图(左图为以四个胚胎细胞样本经mda扩增后产物的为模板进行pcr反应的电泳结果，右图为基因芯片检测呈现的snp位点分布图(黑点)、染色体拷贝数拟合线(中间曲线)以及相应的call_ratio值(标注在图的上方))。
【具体实施方式】
[0026]
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0027]
实施例1：
[0028]
一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，包括如下步骤：
[0029]
包含8对引物，分别扩增8个管家基因的相应dna片段，包括如下步骤：
[0030]
1)所用的8对引物序列合成后，采用pag法纯化并冻干成粉末状保存、运输；
[0031]
2)将8对引物分别用ddh2o稀释成100μmol/l的母液，再各取20μl上下游引物母液混合在一起并调整浓度至10μmol/l，制备成引物工作液；
[0032]
3)吸取2μl引物工作液，采用hifi酶进行pcr反应，反应体系和热循环条件如下：10
×
hifi buffer i 2.5μl dntp 2μl 2μl混合引物 0.5μl hifi polymerase dna溶液2μl ddh2o 16μl，混均，总反应体积为25μl。94℃变性3min，94℃30s
→
61℃40s
→
72℃1min，循环35次，72℃延伸3min；
[0033]
4)pcr反应结束后，取10μl产物并加入2μl 6
×
dna loading buffer混匀后，在2％琼脂糖凝胶上电泳，120v，35min，然后在凝胶成像仪上紫外光成像；如果模板dna质量较好，理论上可以扩增出8条产物。如果只有6个及以上扩增产物，则说明该模板dna可用于下游基因芯片检测，且条带越多、越清晰明亮，表明模板dna的质量越好，基因芯片的检测结果越理想；
[0034]
所用的8对引物序列和扩增产物的片段长度如下所示：
[0035][0036]
实施例2：
[0037]
一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，步骤3)中采用高效聚合酶(hifi高保真酶，transtaq dna polymerase)，其余同实施例1一样。
[0038]
实施例3：
[0039]
一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，步骤3)的pcr反应中采用wga产物，其余同实施例1一样。
[0040]
结果分析：
[0041]
图1是本发明实施例1中8对引物扩增后琼脂糖电泳结果的图以及基因芯片分析结果：
[0042]
左图为以三个胚胎细胞样本经mda扩增后产物的为模板进行pcr反应的电泳结果，右图为基因芯片检测呈现的snp位点分布图(黑点)、染色体拷贝数拟合线(中间曲线)以及相应的call_ratio值(标注在图的上方)。以yrq3样本为模板可扩增出5个产物，对应在call_ratio值为0.89，snp位点基因分布散乱；以yrq2样本为模板可扩增出6个产物，其call_ratio值为0.91，snp位点相对集中在红线两侧；yrq1样本为模板可扩增出7个产物，其call_ratio值为0.93，snp位点较集中在红线两侧。电泳图的左侧标出了8个qc产物的位置，右侧标注dna marker的大小。电泳在2％琼脂糖凝胶中进行。
[0043]
图2是本发明实施例1中8对引物扩增后琼脂糖电泳结果的图以及基因芯片分析结果：
[0044]
左图为以四个胚胎细胞样本经mda扩增后产物的为模板进行pcr反应的电泳结果，右图为基因芯片检测呈现的snp位点分布图(黑点)、染色体拷贝数拟合线(中间曲线)以及相应的call_ratio值(标注在图的上方)；以ty1样本为模板可扩增出6个产物，ty2
‑
4样本为模板可扩增出7个产物，其对应的call_ratio值均大于0.92，call_ratio值越大，snp位点越集中于红线两侧，分析染色体拷贝数异常越准确。电泳图的左侧标出了8个qc产物的位置，右侧标注dna marker的大小；电泳在2％琼脂糖凝胶中进行。
[0045]
图3是本发明实施例1中8对引物扩增后琼脂糖电泳结果图以及基因芯片分析结果：
[0046]
左图为以四个胚胎细胞样本经mda扩增后的产物为模板进行pcr反应的电泳结果，右图为基因芯片检测呈现的snp位点分布图(黑点)、染色体拷贝数拟合线(中间曲线)以及相应的call_ratio值(标注在图的上方)；以lzm7样本为模板可扩增出5个产物，其call_ratio值为0.90；以lmz5
‑
6和lmz8样本为模板可扩增出6
‑
7个产物，其对应的call_ratio值均大于0.94，call_ratio值越大，snp位点越集中于红线两侧，分析染色体拷贝数异常越准确。电泳图的左侧标出了8个qc产物的位置，右侧标注dna marker的大小；电泳在2％琼脂糖凝胶中进行。
[0047]
总结：
[0048]
1、现有技术中暂时没有一个对mda扩增产物的完整性和可扩增性的检测方法，目前主要是通过琼脂糖凝胶电泳来检测mda产物的片段大小和相对含量，而如果要对其片段完整性进行分析，需要先对产物进行纯化，然后再用qubit或者安捷伦高敏生物分析仪2100进行定量分析。但是，这样的检测方法所需的费用较高，且在纯化过程中dna回收率低，会造成mda扩增产物的损失。我们通过实施例1
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3可以看到，采用本发明所述的一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，只需在一个反应管内进行一次pcr扩增，就可以较直观的检测出模板dna的可扩增性，操作过程简易，对检测环境要求低，无毒无害，便于掌握，而且所需的分析费用极低，平均检测一次3
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5元(不计仪器损耗)。
[0049]
2、本发明所述的一种对mda单细胞全基因组扩增产物的质控方法，多态性极好，基因分型清楚，软件读取数据便捷，不易出错，而且parms
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pid2检测结果准备可靠。
[0050]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制。