黑莓内参基因及其引物和应用的制作方法

1.本发明属于植物分子生物学领域，更具体地说，涉及黑莓内参基因及其引物和应用。


背景技术：

2.黑莓和树莓是世界4大小浆果树种中悬钩子属的重要成员。目前，世界上黑莓和树莓具有许多优良品种，其中树莓因品种的不同，果实呈现出不同的颜色，例如黄色、红色和黑色。黑莓和树莓因果实含有丰富的花色苷、多种有机酸、膳食纤维、维生素和矿物质等，还具有抗氧化、抗癌和抗心血管疾病等药用功能。随着人们对健康饮食的日益重视，黑莓果实以独特的风味和药用功效彰显出广阔的发展前景。
3.实时荧光定量pcr(quantitative real
‑
time fluorescent polymerase chain reaction，qrt
‑
pcr)技术作为一种常用的检测基因表达量的方法，已广泛应用于疾病诊断与检测、药物研发和科学研究等领域，具有定量准确、可重复性和高灵敏性等优点。利用qrt
‑
pcr对目的基因的相对表达量进行计算(数据标准化处理)时，需要结合较稳定的内参基因以进行校正和均一化，提高定量结果的准确性。常用的内参基因通常为细胞中表达稳定的管家基因，即在生物体各类细胞中都表达，编码维持细胞基本生命活动所必需蛋白质的基因，如光合作用中碳固定循环的关键酶甘油醛
‑3‑
磷酸
‑
脱氢酶基因(glyceraldehyde
‑3‑
phosphate dehydrogenase，gapdh)，真核生物体内含量最多的核糖体rna 18s基因，真核生物延伸因子1(eef1)家族的eef1a和eef1b蛋白等。理想的内参基因需要在不同处理下、不同组织器官中及细胞不同发育时期中的表达都相对恒定，然而研究表明在实际实验中并没有内参基因能够在任何条件、细胞类型和组织发育阶段都稳定表达。如果直接使用未经筛选的内参基因，会导致实验数据出现偏差，影响目的基因表达水平结果的可靠性，所以需要根据具体实验材料和条件筛选表达相对稳定的内参基因。
4.近年来，已发展不同物种、品种和组织内参基因筛选的研究，在蓝莓和银杏等果树中均筛选出最合适内参基因，以用于开展生长发育、果实成熟和逆境响应等机理研究，然而目前尚未有黑莓和树莓相关内参基因筛选的报道，也未有对黑莓和树莓等相关基因开展功能基因验证的工作。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供黑莓的内参基因18s基因和eef1a基因及其引物。本发明所要解决的另一技术问题在于提供述前述黑莓的内参基因18s和eef1a基因及eef1a基因引物在黑莓和树莓中荧光定量的应用。
6.为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：
7.黑莓内参基因，为黑莓eef1a基因或黑莓18s基因，所述黑莓eef1a基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述黑莓18s基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
8.所述黑莓eef1a基因作为内参基因在黑莓不同果实发育阶段或黑莓各个组织中荧
rna，40s)，α微管蛋白(tubulin alpha chain
‑
like protein，tuba)，伸长因子1
‑
α(elongation factor 1
‑
alpha，eef1a)，延伸因子1
‑
β(elongation factor 1
‑
beta，eef1b)，真核起始因子4a(eukaryotic initiation factor4a，ef4a)，f
‑
box蛋白(f
‑
box)，多泛素结合酶(polyubiquitin conjugating enzyme，ubc)，泛素延伸蛋白(ubiquitin extension protein，ubq)，磷脂酶a(phospholipase a，pa)和磷酸甘油酸激酶(phosphoglycerate kinase，pgk)。qrt
‑
pcr引物采用oligo6.0软件设计引物(表1)，退火温度在60
‑
61℃之间。
27.表1候选内参基因的引物序列
[0028][0029]
3、rna提取和cdna反转
[0030]
参照植物总rna提取试剂盒(百泰克)使用说明书方法提取黑莓和树莓不同品种、组织和果实发育阶段的rna。通过1.5％(w/v)的琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性和纯度，使用nanodrop 2000检测rna的浓度。使用primescriptrt试剂盒(takara，dalian，china)对每个样品总rna(1μg)参照说明书进行逆转录成cdna，获得的cdna稀释5倍保存在
‑
20℃冰箱用于后续qrt
‑
pcr实验。
[0031]
4、qrt
‑
pcr反应程序
[0032]
采用tb green premix ex taq ii(tli rnaseh plus)(takara，dalian，china)进行qrt
‑
pcr反应，体系为20μl：包括10μl tb green premix，0.6μl上下游引物(10μmol/l)，0.6μl of rox reference dye ii，1.5μl of cdna模板，剩余的加入ddh2o。实验使用abi viia 7 real
‑
time pcr platform，反应程序：(i)预变性阶段：95℃，30s；(ii)pcr返样程序：在95℃3s和60℃退火30s的条件下进行40次循环，扩增反应结束后再利用熔解曲线检测产物特异性，(iii)熔解曲线阶段程序：95℃，15s；60℃，60s；95℃，15s。
[0033]
5、数据处理与分析
[0034]
通过excel 2013软件对黑莓和树莓不同品种的组织和果实发育阶段的qrt
‑
pcr数据整理和汇总(样品循环阈值cycle threshold，ct值)。在严格遵循算法原则前提下使用
genorm、bestkeeper和normfinder内参基因稳定性分析软件评估不同内参基因在黑莓和树莓中的表达稳定性。简单的来说，genorm软件根据两个内参基因之间的两两变异计算平均表达稳定性测量值(m)，逐步剔除表达稳定性最差的基因。normfinder根据方差分析对内参基因计算稳定性值s(stability value)，稳定值越小，稳定性越高。bestkeeper通过计算所有候选基因原始ct值的标准差(sd)和百分比协方差(cv)来评估候选基因表达稳定性，sd值越低、cv值越低、r值越高，候选基因表达越稳定。
[0035]
6、结果分析
[0036]
1)12个候选参考基因在所有样本中的循环阈值(ct)值分析
[0037]
本技术选择12个基因(18s，30s，40s，tuba，eef1a，eef1b，ef4a，f
‑
box，ubc，ubq，pa，and pgk)作为候选内参基因，引物退火温度在60
‑
61℃，扩增产物长度在70
‑
200bp。使用不同树莓和黑莓的组织样本和果实发育时期作为模板，分别对不同候选内参基因进行扩增，通过qrt
‑
pcr的溶解曲线评估引物的特异性，结果显示所有目标内参基因均有特异单峰，即所有引物特异性较好，可用于qrt
‑
pcr基因表达水平分析。12个候选内参基因的表达水平分析结果发现，ct值在所有样本中(72个)存在显著差异，且树莓和黑莓不同品种间内参基因ct值也存在区别(图1)。在所有样品中，ct值在22.101至31.549区间变动，平均值为25.453。eef1a和18s基因表达量变化范围最小(24.607
‑
25.381；23.037
‑
23.893)，pa和pgk基因表达量变化范围最大(22.322
‑
29.277；22.249
‑
28.238)。
[0038]
2)genorm软件的稳定性评估
[0039]
genorm软件算法利用m值和标准化因子的配对变异v值确定候选内参基因的稳定性和适合内参的数量。m值的阈值为1.5，小于1.5说明该基因适合做内参，反之则不适合做内参；且m值越小则内参基因的表达就越稳定。在所有样品中，18s和eef1a是最稳定的内参基因，其次是tuba，再者是ef4a(图2a)；在3种树莓，所有果实发育阶段(红黄黑树莓和黑莓的所有果实发育阶段)，树莓果实发育阶段，黄树莓各个组织和黄树莓果实发育阶段中，18s和eef1a仍是最稳定的内参基因(figure 2b，c，d，g，k)，在黑莓各组织和果实发育阶段中，tuba/eef1a是最稳定的(图2h，1)。在黑树莓各组织、红树莓各组织和红树莓果实发育阶段中，最稳定的内参基因分别是tuba/eef1a，tuba/ubc和eef1a/ef4a(图2e，f，i)。在所有候选内参基因的m值均小于1.25。
[0040]
此外，在genorm程序中还可计算引入1个新基因后标准化因子的配对变异v值，并根据vn/vn 1值来确定所需最适内参的数目。在所有样本中v2/3的比值小于推荐值0.15(图3)，说明在所有样本综合分析中，内参基因的使用数量至少应该是2个。其他各个实验分组中，v2/3均小于0.15，表明最佳内参基因使用数量均为2个(图3)。
[0041]
3)normfinder软件的内参稳定性评估
[0042]
与genorm类似，normfinder软件中每个候选内参基因稳定性也是基于候选内参基因的稳定值(stability value)，s值越低，稳定性越高。在所有样品，3种树莓和黑莓果实不同发育阶段都是18s最稳定(图4a，b和l)，在所有果实发育阶段、树莓果实发育阶段、红树莓果实发育阶段和黄树莓果实发育阶段中都是ef4a最稳定(图4c，d，i and k)。红树莓各组织和黄树莓各组织中最稳定的内参是ubc基因(图4e，g)。在黑树莓各组织和黑莓各组织中内参基因的稳定性是eef1a(图4f，h)，而在黑树莓果实发育阶段中内参基因的稳定性是18s＞eef1a＞ef4a(图4j)，综合分析pgk基因(7/12)的稳定性最差(图4)。
[0043]
4)bestkeeper软件的内参稳定性评估
[0044]
bestkeeper软件根据每个基因的ct值直接计算变异系数(cv)，标准差(sd)和相关系数(r)三个变量。通常情况下稳定的内参基因具有较小的sd值，并且sd值大于1的基因被认为是不稳定表达基因(不可接受的)。bestkeeper分析结果表明，在所有样品、3种树莓、所有果实发育阶段、黄树莓各组织、黑莓各组织和黑莓果实发育阶段中的eef1a值均最小，所以这6组中eef1a最稳定。在树莓果实发育阶段、红树莓各组织、红树莓果实发育阶段和黄树莓果实发育阶段这4组中18s基因最稳定。在黑树莓各组织和黑树莓果实发育阶段这两组中潜在内参基因的稳定性排序前三均为：tuba＞18s＞eef1a(表2
‑
1～2
‑
4)。
[0045]
表2
‑
1基于bestkeeper软件对12个候选内参基因的稳定性分析
[0046][0047][0048]
表2
‑
2基于bestkeeper软件对12个候选内参基因的稳定性分析
[0049][0050][0051]
表2
‑
3基于bestkeeper软件的12个候选参考基因稳定性分析
[0052][0053]
表2
‑
4基于bestkeeper软件的12个候选参考基因稳定性分析
[0054]
[0055][0056]
5)综合排序分析
[0057]
由于genorm、normfinder和best keeper三种统计算法原理的不同，得到最稳定内参基因的结果有所差异，所以本发明采用三种统计算法中的稳定性排序值(ranking value)相加，排序值总和(the sum of gene stability ranking in three algorithms)作为一个新的变量，代表对基因表达稳定性的综合评价。排序值越小，表明基因表达稳定性越高。综合分析结果表明，所有样品、3个树莓、果实不同发育阶段和黄树莓各组织中eef1a和18s为稳定性最高的内参(表3
‑
1～
‑3‑
2)。除了红树莓果实发育阶段中18s的稳定性排名第4，其他各样本间都均位于前三；除了红树莓各组织中的eef1a稳定性排名第4，其他各样本间都均位于前三。综上所述，在所有样本分析中eef1a和18s作为最稳定的内参基因组合。
[0058]
表3
‑
1 12个候选内参基因的综合分析排名
[0059]
[0060]
[0061][0062]
注：g：genorm中的基因表达稳定性排序。
[0063]
n：normfinder中的基因表达稳定性排序。
[0064]
b：bestkeeper中的基因表达稳定性排序。
[0065]
s：三种算法的基因稳定性排序之和
[0066]
表3
‑
2 12个候选内参基因的综合分析排名
[0067]
[0068][0069]
注：g：genorm中的基因表达稳定性排序。
[0070]
n：normfinder中的基因表达稳定性排序。
[0071]
b：bestkeeper中的基因表达稳定性排序。
[0072]
s：三种算法的基因稳定性排序之和
[0073]
6)选定参考基因的验证
[0074]
为了验证稳定的参考基因的可靠性，使用内参基因在黑莓不同组织和果实发育阶段的来检测rucyp73a基因的相对表达模式。从上述分析中选择的两个最稳定参考基因(eef1a和18s)和最不稳定参考基因(pgk)单独或组合用于qrt
‑
pcr分析。尽管rucyp73a基因的整体相对表达模式显示出相似的趋势，但当数据标准化为不同参考基因的数据时，发现了差异(图5)。当我们使用单个基因作为参考基因时，观察到类似的表达模式。然而，当使用最不稳定基因(pgk)作为参考基因时，rucyp73a的表达水平出现显著波动，绿色果实和转色期果实的表达模式与使用更合适的参考基因时观察到的表达模式不一致(图5)。
[0075]
本发明为了标准化qrt
‑
pcr的基因表达数据，首次尝试在悬钩子不同品种以及不同组织部位中筛选稳定性较高的一组候选内参基因。基于genorm、normfinder、bestkeeper和综合分析，结果显示eef1a和18s在所有样品中稳定表达，是相对合适的内参基因组合，为今后树莓和黑莓的基因表达分析的准确性奠定了基础。