一种新型光电/可视化双模式传感器的构建方法及其在呕吐毒素检测上的应用与流程

1.本发明属于光电化学生物传感技术领域，主要涉及一种新型光电/可视化双模式传感器的构建方法及其在呕吐毒素检测上的应用。


背景技术：

2.光电化学传感器是基于光电活性物质的光电转换特点来确定检测物的浓度。光电化学检测灵敏度高是由于激发光源的输入与检测信号的输出形式不同，这种信号检测模式极大地减少了背景信号的干扰。其次光电化学检测还有响应速度快、灵敏度高、设备简单等优点，这让它能够在众多的检测方法中脱颖而出。传统的光电化学传感分析一般采用体积较大的电化学工作站作为电信号收集设备。
3.光电致变色可视化传感器是一种基于电致变色原理的检测技术，这种检测技术利用光敏材料能够在光激发下产生光电流的特点，将其应用在电致变色的电信号响应光学性能的变化上。光电致变色传感器具有操作步骤简单、检测结果可以直接肉眼观察以及无需外接仪器检测易于便携等优点，这让其在环境检测，食品检测领域具有广泛的应用，但是光电致变色存在着检测精度不高的问题，这就限制了它的应用范围。
4.呕吐毒素又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(don)是b型的单端孢霉烯族真菌毒素，don理化性质稳定，在粮食中稳定存在。人或者动物食用含超标准量的don食物后，会出现恶心、厌食等症状，严重的会造成破坏免疫机制以及对内脏造成创伤导致出血等。鉴于don的危害性，已被联合国粮农组织和世界卫生组织定为最危险的自然发生的食品污染物，也被国际癌症研究机构公布为三类致癌物质。目前，对于don的检测方法有酶联吸附免疫法、电化学免疫传感检测、生物传感器检测等。以上检测方法的检测方式单一、操作复杂、不便携并且不能实现现场快速检测。因此，开发一种检测模式灵活、快速、简单便携、成本低的分析方法是十分有必要的。


技术实现要素：

5.本发明旨在提供集快速、简单、微型化、使用模式灵活等优点为一体的便携式光电/可视化适配体传感器应用于don毒素的检测，在ito上设计两个检测区域，实现以电化学工作站作为数据读出的光电检测和基于普鲁士蓝颜色变化的光电致变色可视化检测。
6.本发明中光电/可视化双模式传感器件的构建方法，包括如下步骤：
7.步骤1、制备光电材料二氧化钛三维氮杂石墨烯水凝胶(tio2/3dngh)：
8.首先，将甘氨酸与硫酸钛加入氧化石墨烯分散液中，超声分散形成均匀的溶液a。然后，将溶液a转移到高压反应釜并在烘箱中进行溶剂热反应，至此便成功制备出了tio2/3dngh纳米复合材料。最后，待其自然冷却至室温后经过多次水洗，然后冷冻干燥，从而制备了固体产物tio2/3dngh。
9.步骤2、制备光电/可视化电极基底
10.将ito依次在甲苯、丙酮、乙醇和水超声清洗下，以去除表面可能吸附的杂质与有机污染物。在干净的ito上激光刻蚀出可视化区域、对电极区域和工作电极区域；
11.步骤3、制备可视化电极
12.在ito的可视化区域电沉积普鲁士蓝，形成可视化电极；
13.具体为：采用三电极体系：工作电极为ito中的可视化区域、辅助电极为铂丝、参比电极为甘汞电极，在以kcl、hcl、k3[fe(cn)6]和无水fecl3组成的沉积液中用循环伏安法沉积普鲁士蓝，将制备完成的可视化电极置于温度为60℃的烘箱中过夜。
[0014]
电沉积参数设置为低压0.4v，高压0.8v，扫描速率100mv/s，扫描次数25次。电沉积600s结束后用超纯水缓慢冲洗电极，60℃干燥一夜以备用。
[0015]
步骤4、制备对电极：
[0016]
在ito的对电极区域电沉积pt，形成pt/ito电极；
[0017]
在电沉积之前，向溶液中通入高纯氮气以除去镀液中溶解的氧。电沉积采用三电极体系：工作电极为ito的对电极区域、辅助电极为铂丝、参比电极为甘汞电极，在h2ptcl6和h2so4组成的镀液中，利用恒电压沉积法,于ito对电极区域进行电化学沉积。沉积完成后将pt/ito电极进行清洗，后将其放入干燥皿中保存备用。
[0018]
步骤5、修饰工作电极：
[0019]
将步骤1中得到的固体产物tio2/3dngh分散于n,n
‑
二甲基甲酰胺(dmf)中，得到tio2/3dngh分散液，将tio2/3dngh分散液滴涂于ito的工作电极区域，置于红外灯下烘干，得到tio2/3dngh电极作为工作电极。
[0020]
步骤6、构建检测don毒素的光电/可视化双模式适配体传感器件
[0021]
首先，在工作电极tio2/3dngh/ito上滴涂壳聚糖(chit)溶液，置于红外灯下烘干；接着，将戊二醛(ga)溶液滴于电极表面，并置于室温下反应，反应完毕后，用pbs淋洗，除去电极表面多余的ga；用pbs为溶剂配制don适配体溶液，将don适配体滴加在电极上，反应一段时间后，用pbs淋洗以除去过量的未吸附的适配体，然后滴加牛血清蛋白(bsa)溶液以封闭非特异性活性位点；以上修饰区域是工作电极区域。最终得到适配体修饰的工作电极(aptamer/tio2/3dngh/ito),与对电极pt/ito构成光电适配体传感器件和与显色区域构成光电致变色适配体传感器件的光电/可视化双模式适配体传感器。
[0022]
步骤1中，
[0023]
所述的溶液a中，甘氨酸、硫酸钛、氧化石墨烯分散液的用量分别为1g，2.4g，
[0024]
10ml，按比例调配。其中氧化石墨烯分散液浓度为2.0mg/ml。
[0025]
所述溶剂热反应的温度为160℃～200℃，反应时间为10～14h。
[0026]
步骤2中，超声的时间为30min。
[0027]
步骤3中，所述沉积液中，kcl和hcl的浓度均为0.1mol/l；k3[fe(cn)6]和无水fecl3的浓度均为0.0025mol/l。
[0028]
步骤4中，
[0029]
所述镀液中，h2ptcl6的浓度为3mmol
·
l
‑1，h2so4的浓度为0.5mol
·
l
‑1；
[0030]
恒电压法电沉积的参数为电压为
‑
0.3v，时间为700s；
[0031]
通入高纯氮气(99.999％)的时间为30min。
[0032]
步骤5中，
[0033]
所述chit的质量百分浓度为0.1％，滴加量10μl；
[0034]
所述ga的体积百分浓度为2.5％，滴加量20μl；chit与ga反应时间为1～2h；
[0035]
don适配体序列为：5'
–
nh2
‑
c6
‑
gcatcactacagtcattacgcatcgtaggggggatcgttaaggaagtgcccggaggcggtatcgtgtgaagtgctgtccc
‑
3'；don适配体浓度为2μm，滴加量为20～40μl，反应时间10～14h；bsa的质量百分浓度为3％。
[0036]
将本发明制备的光电/可视化适配体传感器件光电化学检测模式下用于检测呕吐毒素don的用途，具体步骤为：
[0037]
(1)将不同浓度的don溶液滴到aptamer/tio2/3dngh/ito工作电极上，并在室温下孵育一段时间；
[0038]
(2)将步骤(1)处理过的工作电极放入含有的pbs的电解池中，氙灯光源同时垂直照射双功能的ito上，用导电胶带连接工作电极与对电极，电化学工作站输出光电信号；将光电流值与don浓度的对数值做标准曲线；
[0039]
(3)将未知浓度的don溶液采用如上方法收集光电流信号，并代入标准曲线中，得出don溶液的浓度。
[0040]
步骤(1)中，don浓度为0.001～0.1pg/ml，具体为0.001,0.01,0.1,0.5,1,5,和100pg/ml，滴加量为10～30μl；
[0041]
步骤(2)中，pbs量为30～50ml；氙灯光源的强度为25％～100％。
[0042]
将本发明制备的光电/可视化适配体传感器件可视化检测模式下用于检测呕吐毒素don的用途，具体步骤为：
[0043]
(1)将不同浓度的don溶液滴到aptamer/tio2/3dngh/ito工作电极上，并在室温下孵育一段时间；
[0044]
(2)将步骤(1)处理过的工作电极放入含有的pbs的电解池中，氙灯光源同时垂直照射双功能的ito上，以普鲁士蓝颜色变化作为输出信号；将普鲁士蓝灰度值的变化与don浓度做标准曲线；
[0045]
(3)将未知浓度的don溶液采用如上方法收集信号，并代入标准曲线中，得出don溶液的浓度。
[0046]
步骤(1)中，don浓度为1～250ng/ml，具体为1,10,50,100,150和250ng/ml，滴加量为10～30μl；
[0047]
步骤(2)中，pbs量为30～50ml；氙灯光源的强度为25％～100％。
[0048]
本发明的有益效果为：
[0049]
本发明以带有功能区域的ito为基底，以修饰tio2/3dngh纳米颗粒的区域作为工作电极，电沉积pt纳米颗粒的区域作为对电极，沉积普鲁士蓝的区域作为可视化区域，成功建立了光电/可视化适配体传感器，实现对don毒素的双模式分析检测，其特色和优点表述如下：
[0050]
(1)本发明制备tio2/3dngh纳米颗粒作为工作电极,电化学沉积的pt纳米颗粒作为对电极，普鲁士蓝作为变色区域来构建光电/可视化适配体传感器，光电信号输出性能稳定，变色信号明显。
[0051]
(2)本发明制备pt纳米颗粒作为对电极，基于本发明的电极可以实现对don毒素的检测，无需外接对电极，降低电极连接的复杂性、降低了成本。
[0052]
(3)本发明所提出的光电/可视化适配体传感器实现了对don的灵敏检测，光电模式下，在0.1～100pg/ml的浓度区间内，don浓度的对数值(log c
don
)与电化学工作站的光电信号输出值(
△
i，
△
i＝i－i0，i表示光照时的光电流，i0表示不光照时的背景信号)呈现良好的线性关系，检出限可达0.33fg/ml。可视化模式下，在1～250ng/ml的浓度区间内，don浓度与普鲁士蓝灰度值的变化(δg)呈现良好的线性关系，检出限可达0.33ng/ml。
[0053]
(4)本发明构建的光电/可视化适配体传感器在光电检测模式下不需要传统的三电极体系的连接方式检测。基于本发明的电极，既可以实现室内高精度的光电化学检测，也可以实现在室外的光电致变色的检测，达到及时检测的目的，使用模式灵活。
附图说明
[0054]
图1为构建的光电/可视化双模式适配体传感器的机理图；
[0055]
图2为本发明ito电极区域示意图；
[0056]
图3、为制备的tio2/3dngh的扫描电子显微镜图(a)、透射电镜图(b)、x
‑
射线衍射图(c)；
[0057]
图4(a)、(b)为光电检测模式下don浓度与光电响应关系图，(c)光电模式下传感器特异性的检测结果图。
[0058]
图5(a)为可视化模式下don浓度与普鲁士蓝灰度值变化关系图，(b)可视化模式下传感器特异性测试的结果图。
具体实施方式
[0059]
以下结合实例对本发明进行详细描述，但本发明不局限于这些实施例。
[0060]
图1为构建的光电/可视化双模式适配体传感器检测的机理图，图2为本发明ito电极区域示意图。
[0061]
实施例1：
[0062]
(1)tio2/3dngh的制备
[0063]
将100.0mg甘氨酸与0.24g硫酸钛加入10ml氧化石墨烯分散液中(go，2.0mg/ml)，超声分散1h形成均匀的溶液a。然后，将溶液a转移到高压反应釜并在烘箱中保持180℃加热12h。最后，待其自然冷却至室温后经过多次水洗，然后冷冻干燥两天，得到tio2/3dngh纳米颗粒。至此便成功制备出了tio2/3dngh纳米复合材料，材料表征如图3所示。
[0064]
(2)修饰双模式电极的制造
[0065]
在制备电极之前，先对ito进行预处理。将ito电极置于1m氢氧化钠溶液中煮沸30分钟，再依次用丙酮、蒸馏水和乙醇超声清洗，氮气吹干备用。用激光刻蚀将带有功能区域的图案呈现在干净的ito上，将光电致变色区域置于普鲁士蓝溶液中，用循环伏安法电沉积，得到pb/ito作为可视化区域。
[0066]
将ito的对电极区域置于3mmol
·
l
‑1h2ptcl6和0.5mol
·
l
‑1h2so4组成的镀液中，利用恒电压沉积法,在
‑
0.3v，700s条件下,于ito表面进行电化学沉积，得到由铂纳米粒子构成的对电极。
[0067]
用1cm*1cm的正方形茶色耐高温胶带将工作电极区域固定，称取2mg tio2/3dngh分散于1ml dmf中，得到tio2/3dngh分散液，移取20μl tio2/3dngh分散液均匀滴涂于工作电
极区域，置于红外灯下烘干，得到tio2/3dngh/ito。
[0068]
在光电检测模式下，将光电/可视化双模式电极放入含有的磷酸缓冲液(pbs)的电解池中，用氙灯垂直照射在电极上，用导电胶带连接工作电极与对电极，用电化学工作站读取信号完成光电检测。
[0069]
在可视化检测模式下，将光电/可视化双模式电极放入含有的磷酸缓冲液(pbs)的电解池中，用氙灯垂直照射在电极上，用肉眼观看光电致变色区域普鲁士蓝的变色情况，完成光电致变色检测。
[0070]
其中，pbs浓度为0.1mol/l,ph＝7.4。
[0071]
(3)光电/可视化适配体传感器件的构建
[0072]
首先，在工作电极tio2/3dngh/ito上滴涂10μl壳聚糖(chit)溶液，置于红外灯下烘干。接着，将20μl2.5％戊二醛(ga)溶液滴于工作电极表面，并置于室温下反应1h，反应完毕后，用pbs(ph＝7.4，0.1mol/l)淋洗，除去电极表面多余的ga。用pbs(ph＝7.4，0.1mol/l)为溶剂配制浓度为2μm don适配体溶液，don适配体序列为：5'
–
nh2
‑
c6
‑
gcatcactacagtcattacgcatcgtaggggggatcgttaaggaagtgcccggaggcggtatcgtgtgaagtgctgtccc
‑
3'。将体积为20μl的don适配体滴加在电极上，置于4℃冰箱中反应12h，用pbs淋洗以除去过量的未吸附的适配体，然后滴加20μl 3％牛血清蛋白(bsa)溶液以封闭非特异性活性位点，最终得到适配体修饰的工作电极(aptamer/tio2/3dngh/ito)，与对电极pt/ito构成光电适配体传感器件，与普鲁士蓝为可视区域构成可视化适配体传感器件。
[0073]
光电/可视化适配体传感器件检测don
[0074]
此后，在光电检测模式中，将20μl浓度为0.001,0.01,0.1,1,5，10和100pg/ml的don分别滴到aptamer/tio2/3dngh/ito电极上，并在室温下孵育一段时间。最后，将aptamer/tio2/3dngh/ito放入含有20ml的pbs(ph＝7.4，0.1mol/l)的电解池中，经过电化学工作站读出检测信号，在氙灯光源(强度为25％～100％)垂直照射下进行电化学分析。
[0075]
检测结果如图4、5：
[0076]
图4中(a)、(b)为不同don浓度下传感器在光电模式下的光电流数值，从图中可以看出，随着don浓度的增大，光电流的数值逐渐增大，在0.001～0.1pg/ml的浓度区间内，光电流数值与don浓度之间呈现良好的线性关系，检出限可达0.33fg/ml。
[0077]
图5中为不同don浓度下传感器在可视化模式下的检测结果。从结果可知，随着don浓度的增大，普鲁士蓝的颜色越透明，灰度值的变化越大。在1～250ng/ml的浓度区间内，don浓度与普鲁士蓝灰度值的变化速度呈现良好的线性关系，检出限可达0.33ng/ml。