一种矮牵牛耐涝性综合鉴定方法与流程

1.本发明属于植物栽培与育种技术领域，尤其涉及一种矮牵牛耐涝性综合鉴定方法。


背景技术：

2.矮牵牛(petunia hybridvilm.)，又名碧冬茄、灵芝牡丹等，为茄科多年生草本植物，原产南美洲，忌水湿、低温，喜阳光，夏季是矮牵牛开花的旺季，适宜将其种植在ph为5.8
‑
6.0的微酸性土壤中，并确保通风和排水设施良好。矮牵牛因其出色的花型、丰富的花色、长达数月的花期，栽培容易,受到大众的喜爱，已成为重要的园艺花卉植物,在世界各地广泛栽培。国外进行矮牵牛的育种工作至今已有两百年的历史，我国矮牵牛的育种工作起步较晚，国内对矮牵牛非生物胁迫方面的研究主要集中在低温胁迫、干旱胁迫、盐胁迫。涝渍胁迫是导致生产中花卉品质低下和损耗的危害之一，因此，发掘具有抗逆性的野生优异新种质与进行抗逆分子育种，选育耐涝性强的品种应用于生产，已成为提高花卉抗逆性的两个关键因素。
3.涝渍是植物遭受的主要的非生物胁迫之一，与干旱、高盐和极端气温等非生物因子共同决定了物种的组成和分布。随着全球气候异常，局部地区出现暴雨或长期降雨的现象，再加上自然资源的不合理利用，涝渍已成为当前所面临的最严重的自然灾害之一。减少涝害的主要途径为通过水利设施的建设来降低地下水位以达到排涝降渍，最根本的方法是选育耐涝性较好的品种应用于园林绿化，植物的耐涝能力因不同植物类形、种源、品种而有很大的差异，其实质是基因形差异在表型上的体现，通过建立适宜的耐涝性鉴定方法，可以更加有效的选择耐涝基因形品种。
4.矮牵牛耐涝性综合鉴定是选育矮牵牛优良品种的基础，诸多学者对矮牵牛的抗性加以研究，但有关于矮牵牛耐涝性方面研究却鲜见报道。
5.有鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

6.针对现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种矮牵牛耐涝性综合鉴定方法。
7.为了实现上述目的，本发明提供的一种矮牵牛耐涝性综合鉴定方法，包括如下步骤：
8.步骤1：淹水处理
9.选择生长一致的矮牵牛的8周生根苗，每个株系各18盆，分别进行正常水分处理和涝渍胁迫处理；
10.步骤2：生理生化指标测定与分析
11.测定叶片抗氧化酶活性，包括pod酶活性、sod酶活性和cat酶活性；
12.测定叶片无氧呼吸酶活性，包括adh酶活性、pdc酶活性和ldh酶活性；
13.测定叶片丙二醛含量；
14.测定叶片净光合速率；
15.测定可溶性蛋白含量；
16.测定胞间co2浓度；
17.测定气孔导度；
18.测定蒸腾速率；
19.测定根系活力；
20.21测定叶绿素含量；
21.22用excel统计数据，计算平均值和标准偏差，并运用公式计算综合得分；用spss软件进行分析处理，采用单因素方差分析，用duncan多重比较检验在p＜0.05和p＜0.01水平上不同品种植株的差异，3次重复；运用spss软件对前述单项指标进行主成分分析且进行综合评定，确定矮牵牛耐涝等级；
22.步骤3：评价体系的建立
23.s1：生理生化数据耐涝主成分分析
24.③
总方差解释
25.对前述14个单项指标的耐涝系数进行主成分分析，所述主成分分析包括光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标，根据表1得到总方差解释，所述光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标的贡献率分别为35.658％、22.809％和16.326％，累积贡献率为74.793％；根据表1，光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标代表了前述14个单项指标的74.793％的信息，可分别用光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标对矮牵牛品种耐涝性进行概括分析；
26.表1总方差解释
[0027][0028][0029]
④
主成分表达式
[0030]
前述指标对应的特征向量表达式分别为:
[0031]
z1＝
‑
0.843*zx1
‑
0.475*zx2
‑
0.654*zx3
‑
0.298*zx4 0.726*zx5
‑
0.077*zx6
0.043*xz7 0.551*zx8 0.739*zx9 0.874*zx10
‑
0.096*zx11 0.945*zx12 0.883*zx13
‑
0.301*zx14；
[0032]
z2＝0.301*zx1
‑
0.681*zx2 0.116*zx3 0.847*zx4 0.726*zx5 0.790*zx6 0.597*xz7 0.032*zx8
‑
0.478*zx9 0.204*zx10
‑
0.134*zx11 0.051*zx12
‑
0.332*zx13 0.016*zx14；
[0033]
z3＝0.208*zx1 0.363*zx2 0.052*zx3 0.321*zx4
‑
0.023*zx5
‑
0.012*zx6
‑
.353*xz7 0.633*zx8 0.057*zx9
‑
0.073*zx10
‑
0.849*zx11 0.102*zx12
‑
0.084*zx13 0.855*zx14；
[0034]
其中：z1为光合指标、z2为无氧呼吸指标、z3为抗氧化指标、zx1为pod酶活性、zx2为sod酶活性、zx3为cat酶活性、zx4为ldh酶活性、zx5为adh酶活性、zx6为pdc酶活性、zx7为叶片丙二醛含量、zx8为叶绿素含量、zx9为叶片净光合速率、zx10为气孔导度、zx11为胞间co2浓度、zx12为蒸腾速率、zx13为根系活力、zx14为可溶性蛋白含量；
[0035]
由以上表达式以及表2公开的成分得分系数矩阵可知，所述光合指标中叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、根系活力的系数较大，所述无氧呼吸指标中ldh酶活性、adh酶活性、pdc酶活性、pod酶活性、mda含量的系数较大，所述抗氧化指标中pod酶活性、sod酶活性、cat酶活性、叶绿素含量和可溶性蛋白含量系数较大；
[0036]
表2成分得分系数矩阵
[0037][0038]
s2：生理生化涝害指数综合分析
[0039]
③
综合指标权重
[0040]
所述光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标的贡献率的权重分别为0.4767、0.3050和0.2183，根据综合评价公式＝0.4767*z1 0.3050*z2 0.2183*z3，得到矮牵牛
pherf2转基因株系及其野生型的综合得分，根据得分判定矮牵牛的耐涝性；
[0041]
④
生理生化指标等级评定
[0042]
表3生理生化指标定级范围及得分标准
[0043][0044][0045]
优选地，所述涝渍胁迫处理为对盆栽淹水处理，淹水至根部2
‑
3cm，分别于淹水的0d、1d、2d、3d取处理植株叶片重复3次，取下后放在液氮中，随后转移至
‑
80℃冰箱保存备用。
[0046]
本发明提供的一种矮牵牛耐涝性综合鉴定方法，具有如下有益效果：
[0047]
1.针对矮牵牛耐涝性研究基础薄弱以及耐涝鉴定方法不完善等缺陷，对涝胁迫下对矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型生理生化特性的变化作出研究，为后续矮牵牛耐涝品种鉴定提供了实验依据。
[0048]
2.为后续矮牵牛种质资源耐涝性评价、耐涝机理研究提供依据，在园林绿化应用中可优先选用耐涝性强的品种，减少因涝渍灾害造成的植株死亡，增强矮牵牛的观赏品质和绿化环境。
附图说明
[0049]
图1为本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下pod酶活性的影响(平均值
±
标准误差)。
[0050]
图2为本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下sod酶活性的影响(平均值
±
标准误差)
[0051]
图3本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下cat酶活性的影响(平均值
±
标准误差)。
[0052]
图4为本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下ldh酶活性的影响(平均值
±
标准误差)。
[0053]
图5为本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下adh酶活性的影响(平均值
±
标准误差)。
[0054]
图6为本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下pdc酶活性的影响(平均值
±
标准误差)。
[0055]
图7为本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下mda含量的影响(平均值
±
标准误差)。
[0056]
图8本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下净光合速率的影响(平均值
±
标准误差)。
[0057]
图9本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下气孔导度的影响(平均值
±
标准误差)。
[0058]
图10本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下可溶性蛋白含量的影响(平均值
±
标准误差)。
[0059]
图11本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下叶绿素含量的影响(平均值
±
标准误差)。
[0060]
图12本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下胞间co2浓度的影响(平均值
±
标准误差)。
[0061]
图13本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下蒸腾速率的影响(平均值
±
标准误差)。
[0062]
图14本发明提供的一种鉴定矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型耐涝性的综合评价体系中矮牵牛在涝胁迫下根系活力的影响(平均值
±
标准误差)。
具体实施方式
[0063]
下面结合具体实施例和附图对本发明做进一步说明，以助于理解本发明的内容。
[0064]
如图1
‑
14所示，为本发明提供的一种矮牵牛耐涝性综合鉴定方法，包括如下步骤：
[0065]
步骤1：淹水处理
[0066]
选择生长一致的矮牵牛pherf2过表达株系c、d、i，pherf2缺失型株系1a、1b、4b和野生型wt的8周生根苗，每个株系各18盆，分别进行正常水分处理和涝渍胁迫处理；
[0067]
步骤2：生理生化指标测定与分析
[0068]
23测定叶片抗氧化酶活性，包括pod酶活性、sod酶活性和cat酶活性；
[0069]
24测定叶片无氧呼吸酶活性，包括adh酶活性、pdc酶活性和ldh酶活性；
[0070]
25测定叶片丙二醛含量；
[0071]
26测定叶片净光合速率；
[0072]
27测定可溶性蛋白含量；
[0073]
28测定胞间co2浓度；
[0074]
29测定气孔导度；
[0075]
30测定蒸腾速率；
[0076]
31测定根系活力；
[0077]
32测定叶绿素含量；
[0078]
33用excel统计数据，计算平均值和标准偏差，并运用公式计算综合得分；用spss软件进行分析处理，采用单因素方差分析，用duncan多重比较检验在p＜0.05和p＜0.01水平上不同品种植株的差异，3次重复；运用spss软件对前述单项指标进行主成分分析且进行综合评定，确定矮牵牛耐涝等级；
[0079]
步骤3：评价体系的建立
[0080]
s1：生理生化数据耐涝主成分分析
[0081]
⑤
总方差解释
[0082]
对前述14个单项指标的耐涝系数进行主成分分析，主成分分析包括光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标，根据表1得到总方差解释，光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指
标的贡献率分别为35.658％、22.809％和16.326％，累积贡献率为74.793％；根据表1，光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标代表了前述14个单项指标的74.793％的信息，可分别用光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标对矮牵牛品种耐涝性进行概括分析；
[0083]
表1总方差解释
[0084][0085]
⑥
主成分表达式
[0086]
前述指标对应的特征向量表达式分别为:
[0087]
z1＝
‑
0.843*zx1
‑
0.475*zx2
‑
0.654*zx3
‑
0.298*zx4 0.726*zx5
‑
0.077*zx6 0.043*xz7 0.551*zx8 0.739*zx9 0.874*zx10
‑
0.096*zx11 0.945*zx12 0.883*zx13
‑
0.301*zx14；
[0088]
z2＝0.301*zx1
‑
0.681*zx2 0.116*zx3 0.847*zx4 0.726*zx5 0.790*zx6 0.597*xz7 0.032*zx8
‑
0.478*zx9 0.204*zx10
‑
0.134*zx11 0.051*zx12
‑
0.332*zx13 0.016*zx14；
[0089]
z3＝0.208*zx1 0.363*zx2 0.052*zx3 0.321*zx4
‑
0.023*zx5
‑
0.012*zx6
‑
.353*xz7 0.633*zx8 0.057*zx9
‑
0.073*zx10
‑
0.849*zx11 0.102*zx12
‑
0.084*zx13 0.855*zx14；
[0090]
其中：z1为光合指标、z2为无氧呼吸指标、z3为抗氧化指标、zx1为pod酶活性、zx2为sod酶活性、zx3为cat酶活性、zx4为ldh酶活性、zx5为adh酶活性、zx6为pdc酶活性、zx7为叶片丙二醛含量、zx8为叶绿素含量、zx9为叶片净光合速率、zx10为气孔导度、zx11为胞间co2浓度、zx12为蒸腾速率、zx13为根系活力、zx14为可溶性蛋白含量；
[0091]
由以上表达式以及表2公开的成分得分系数矩阵可知，光合指标中叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、蒸腾速率、根系活力的系数较大，无氧呼吸指标中ldh酶活性、adh酶活性、pdc酶活性、pod酶活性、mda含量的系数较大，抗氧化指标中pod酶活性、sod酶活性、cat酶活性、叶绿素含量和可溶性蛋白含量系数较大；
[0092]
表2成分得分系数矩阵
[0093][0094][0095]
s2：生理生化涝害指数综合分析
[0096]
⑤
综合指标权重
[0097]
光合指标、无氧呼吸指标和抗氧化指标的贡献率的权重分别为0.4767、0.3050和0.2183，根据综合评价公式＝0.4767*z1 0.3050*z2 0.2183*z3，得到矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型的综合得分，根据得分判定矮牵牛的耐涝性；得到矮牵牛pherf2转基因株系及其野生型的综合得分，根据得分判定矮牵牛的耐涝性，得出矮牵牛的耐涝性中pherf2过表达株系c、d、i得分442.637477、245.144908、192.4883114,野生型wt得分389.5663171，pherf2缺失型株系1a、1b、4b得分233.0601382、99.46449107、231.9246488。得出c为耐涝品种，wt为较耐涝品种，1a、4b、d、i为较不耐涝品种、1b为不耐涝品种。
[0098]
⑥
生理生化指标等级评定
[0099]
表3生理生化指标定级范围及得分标准
[0100][0101]
综上可知：pherf2过表达株系c为耐涝品种，野生型wt为较耐涝品种，pherf2缺失型株系1a、4b、pherf2过表达株系d、i为较不耐涝品种、pherf2缺失型株系1b为不耐涝品种。
[0102]
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。