药用太子参病毒基因组全长快速鉴定、克隆技术的制作方法

技术特征：
1.一种药用太子参病毒基因组全长鉴定、克隆方法，其特征在于，以病毒侵染组织、发病组织、营养繁殖器官或常规太子参组织内的srna或转录本数据作为病毒基因组溯源的基础数据，组装、鉴定和克隆获取太子参植株体内病毒基因组信息，并选择常用病毒侵染指示植物本氏烟验证所组装病毒的侵染活性，反馈确证所组装病毒的准确性和真实性，包括以下步骤：步骤1：获取了候选病毒侵染组织或发病部位组织的srna序列，对srna数据集进行质控后，移除srna数据集内的核糖体起源的srna片段，获取相应组织内的转录本信息；步骤2：使用virusdetect、pfor2短序列组装软件对候选病毒侵染组织内的所有srna数据库进行组装，初步获取病毒基因组初级片段；利用trinity对候选病毒组织相关转录本信息进行组装；利用cd
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hit和cap3对不同软件所产生的片段进行去冗余和反复拼接延伸；步骤3：采用分段克隆的方式克隆病毒基因组，并通过改造目前序列最短的克隆载体psmart进行保存；对载体中候选病毒基因组进行测序，将测序结果与预测序列匹配，最终确证所鉴定病毒基因组的序列信息。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2具体包括以下步骤：通过病毒起源srna片段组装virusdetect、pfor2软件对太子参植株的srnas序列的文库进行组装，利用trinity对转录本信息进行组装，初步获取候选病毒基因组相关片段；利用ncbi病毒基因组数据库对候选的病毒片段进行鉴定，移除非病毒片段信息；将过滤留存的病毒基因组相关片段利用cap3进行反复延长，以获取太子参内侵染病毒的完整基因组信息，利用生物信息学方法对所获取的病毒基因组的完整性进行初步鉴定。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述初步鉴定具体包括；将所获取的病毒片段与ncbi的nt数据库进行比对，抽取出比对结果排列前100的序列；对所获取的序列进行手动检查，滤除可能的非病毒基因组和非全长的病毒基因组序列；对这100序列进行多重比对，构建出相应病毒基因组末端保守序列区域，并进行截取；将所获取的候选病毒基因组片段与上述构建的末端保守区进行比较，判定所获取基因组片段是否为相应基因组的全长。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3所述克隆具体包括以下步骤：选择目前长度最小的克隆载体psmart，分段将所获取的病毒克隆至psmart载体，然后，利用载体上的保守区域对所获取的病毒基因组信息进行测序，获取相应病毒基因组在太子参植株体内的真实信息；将克隆载体中的太子参病毒基因组克隆到植物表达载体内，利用根癌农杆菌结合叶片浸润注射方法侵染病毒指示植物本氏烟，验证所克隆病毒基因组的侵染活性。

技术总结
本发明多年生太子参太子参体内病毒快速鉴定技术体系，其步骤主要包括：1）太子参材植株样品的准备与RNA抽提。2）原始样品sRNA处理与拼接，初步获取病毒关联片段。3）病毒关联片段的确定，病毒关联序列的整合组装。4）病毒种类的鉴定，病毒全长序列的判定。4）全长病毒序列的快速克隆，病毒全长序列基因组的校正和获取。5）病毒的复活及侵染活力的鉴定。通过病毒快速组装、全长评测、高效克隆和侵染确证等4个技术体系的有效对接可以从植物体内快速解析出植物体内真实性侵染病毒基因组信息，并鉴定其侵染活力。其侵染活力。其侵染活力。


技术研发人员：古力 李明杰 杨小文 王建明 孙瑞斌 许启棉 林文明 袁飞越 张立栋 张重义
受保护的技术使用者：福建天人药业股份有限公司 焦作市玖道种苗繁育有限公司 泰宁县古农堂生物科技有限公司
技术研发日：2021.05.20
技术公布日：2021/11/2