药用太子参病毒基因组全长快速鉴定、克隆技术的制作方法

1.本发明涉及分子生物工程技术领域，具体涉及营养繁殖太子参植株内长期寄存性病毒病原基因组的鉴定。主要适用于太子参植株体内的烈性以、温和性侵染病毒病原基因组信息的快速鉴定、高效克隆和侵染性评测等完整的技术节点和关键流程。


背景技术：

2.目前，太子参组织内侵染病毒病原鉴定的方法主要包括：常规鉴定方法、电子显微镜观察法、血清学检测法、分子生物学方法等，传统的病毒鉴定方法需要利用太子参病毒侵染组织作为鉴定源，通过电子显微镜结合血清检测初步判定侵染组织细胞内镶嵌病毒颗粒，初步推定出侵染组织的病毒源的侵染特征和侵染烈度。然后，进一步从侵染组织中萃取出病毒侵染液，对未侵染太子参组织或病毒研究模式太子参进行侵染，扩大病毒侵染组织体积、提高病毒组织侵入丰度，在此基础上，分离、纯化或半纯化太子参组织内的侵染病毒核酸，构建病毒基因组库，利用pcr技术结合race技术、tail
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pcr等多重pcr技术鉴定出候选病毒基因组片段信息，然后，通过具有重叠区病毒片段组装最终得到侵染太子参病毒基因组源。
3.传统病毒病原基因组鉴定方法费事、费力，同时，鉴定所需要的周期较长，效率较低。随着现代分子生物技术的发展和高通量测序技术的不断迭代更新，利用高通量测序技术结合不同测序建库技术，批量、实时、高效、轻便从太子参体组织器官内快速、通量的获取其内源、外源的遗传信息片段已经成为现实。由于太子参在病毒侵染太子参宿主的过程中，病毒会促发太子参中的转录后基因沉默系统（post
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transcriptional gene silen
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cing，ptgs），这个系统会将病毒基因组切割成小片段的核酸，这些小片段核酸也被成为病毒起源srna（virus derived srnas，vsrnas）或病毒切割小片段（virus cutted srna，vcrnas）。这些被切割的病毒小片段序列信息，在srna文库的构建过程均可以被有效的捕获。因此，可以根据srna文库的段片段信息，进行逆向组装，可以反向推定出某一侵染太子参体内的病毒基因组信息，重构病毒基因组。因此，利用srna拼接技术逆向推出特定太子参组织内的侵染病毒种类已经成为目前植物病毒信息快速鉴定方法之一，广泛应用于各种太子参组织的侵染病毒组织种类、丰度鉴定。
4.虽然结合高通量测序技术及vsrnas拼接方法鉴定植物病毒基因组的方法已经被广泛的应用在各种植物病毒基因组信息的鉴定，但目前通过这种方法绝大部分只能鉴定到来源于已知侵染病毒的基因组片段信息，即使鉴定到候选病毒基因组长度接近目标病毒基因组长度，但是缺乏有效的评测、界定和判别方法。同时，由于大部分病毒基因组序列较长，常规酶切、连接效率较低，同时，缺乏病毒克隆的专一高效载体，导致通过生物信息拼接所获取的病毒基因组信息无法快速在太子参体内进行真伪性鉴定。因此，通过vsrnas的拼接技术获取太子参体内的寄存病毒的方法，具有高效、快速的特点，并可以在较短时间内勾勒和绘制太子参体内侵染病毒的种类信息。但该方法只能反映出太子参体内侵染性病毒基因组片段，而缺乏对所获取病毒进行深入确证所相配套的技术、方法和体系。
5.为了改善和弥补vsrnas病毒快速鉴定方法技术体系，本发明构建和优化了太子参vsrnas快速组装方法、建立了太子参vsrna组装病毒全长评测技术、筛选和创建了病毒快速克隆体系。通过上述病毒快速组装、全长评测、高效克隆和等3个技术体系的有效对接能够从太子参体内快速解析出太子参体内真实性侵染病毒基因组信息。


技术实现要素：

6.本发明主要是为了在太子参vsrna病毒拼接鉴定技术技术的基础上，搭建一套从病毒序列获取、克隆、侵染到最终确证的完整病毒快速鉴定技术平台。本发明所构建的病毒技术平台只需要病毒侵染组织、发病组织或太子参常规组织内已经测序的srnas数据基础上，并可以快速初步获取太子参组织内所侵染病毒的候选基因组信息。
7.本发明的技术解决方案为：一种太子参体内病毒基因组快速鉴定方法，包括下述步骤：首选利用多重短序列拼接软件对候选病毒侵染组织内的vsrnas进行拼接、去冗余和多轮延伸，初步获取候选组织内来源于病毒的基因组片段集；获取候选病毒片段相似度较高的同源病毒序列，对候选序列和同源序列进行多重比较，鉴定出候选病毒基因组片段同源病毒基因组5’和3’末端保守区域序列信息，将所拼接组装的病毒基因组片段2端与上述所鉴定的病毒保守末端区域进行匹配，初步判定所鉴定基因组片段中的候选全长病毒基因组信息。将候选全长基因组信息与优化的克隆载体连接，并用sanger测序校正拼接病毒基因组。
8.所属的拼接步骤主要：使用virusdetect（http://virusdetect.feilab.net/）、pfor2（http://staff.ustc.edu.cn/~wuqf/2014plos.html）等短序列组装软件对候选病毒侵染组织内的所有vsrnas数据库进行组装，初步获取病毒基因组初级片段。利用cd
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hit和cap3对不同软件所产生的片段进行去冗余和反复拼接延伸。
9.所属的克隆步骤主要包括：采用分段克隆的方式克隆病毒基因组，并通过改造目前序列最短的克隆载体psmart（lucigen）进行保存。对载体中候选病毒基因组进行测序，将测序结果与预测序列匹配，最终确证所鉴定病毒基因组的序列信息。
10.本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：（1）本发明在太子参侵染病毒种类未知情况下，可以快速的捕获和鉴定出病毒基因组的完整信息。
11.（2）本发明省去了传统病毒鉴定的建库、血清检测及多次克隆测序拼接方法，通过多重段序列拼接软件一步到位获取特定组织内的候选病毒基因组信息。（3）本发明中的病毒全长评测技术能够对所获取候选病毒片段的完整性进行初步的鉴定，同时，能够有效的界定出候选病毒所在种属的末端保守区，为病毒克隆的末端克隆提供了有效锚地区域和克隆引物。更为重要的是，病毒基因组的全长潜在性和完整性的初步评测也为保证候选病毒克隆和侵染性的验证提供了重要的信息基础，避免了非全长病毒信息片段转入后续实验所带来的时间和资源浪费。
12.（4）本发明所优化和筛选的克隆载体和同源克隆方法，可以快速、高效的连接和克隆候选病毒基因组片段，能够在短时间内从太子参组织剥离和拯救出病毒信息，极大避免了因带毒组织保存不当或频繁从组织克隆所引发的病毒基因组片段的降解效应，有效阻隔了干扰病毒全长信息获取的外源和内源因素。
13.（5）本发明利用同源克隆方法将候选病毒导入优选短骨架植物表达载体构建成候选病毒的侵染克隆，同时，结合农杆菌侵染方法将植物病毒dna片段引入到植物细胞内，并利用表达载体上的35s启动子在植物细胞内转录病毒rna信息，完成病毒侵染。由于短骨架表达载体的应用，减少了病毒基因组长片段插入和克隆连接难度。同时，相比较传统病毒的摩擦侵染和原核表达结合摩擦侵染的方法，利用植物表达载体和农杆菌介导侵染方法提高了侵染效率，并有效缩短的了侵染液制备时间，也更接近植物原生境中病毒吸附和侵入的过程。
附图说明
14.图1为药用太子参病毒基因组全长鉴定与克隆技术模块。其中，a：关键样品的获取；b：病毒相关片段的vsrnas信息来源；c.太子参花叶病病毒基因组组装流程；d.太子参病毒基因组完整性判断；e.病毒基因组信息的确证。
15.图2为利用本技术所克隆的太子参花叶病核心病原的侵染活性鉴定（用本氏烟作为受体材料）。图示为克隆的太子参花叶病毒载体侵染的后植株形态特征（分别为侵染后3天、5天、12天和22天）；dai表示侵染后天数。
16.图3为本发明所克隆太子参核心病原侵染植株的分子鉴定（用本氏烟作为材料）。图示4个不同侵染时期样品（从右到左依次为：侵染后3天、5天、12天和22天）的检测结果，图中的marker为dl2000，从上到下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。
具体实施方式
17.太子参组织侵染病毒基因组快速鉴定，包括病毒起源vsrna的快速组装、病毒全长评测、病毒快速克隆、病毒全长基因组真实信息确证等个关键技术体系。本研究以太子参病毒根组织内的病毒鉴定作为具体实施案例，步骤如下：1. 以病毒侵染组织、发病组织、营养繁殖器官或常规太子参组织内的srna的数据作为病毒基因组溯源的基础数据。首选，为了捕获来源于太子参感染花叶病毒的基因组片段，分别利用velvet（https://www.ebi.ac.uk/~zerbino/velvet/）、pfor2（http://staff.ustc.edu.cn/~wuqf/2014plos.html）以及virusdetect（http://virusdetect.feilab.net/）将不同样品srna reads组装成contigs。同时，利用trinity（https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki）软件对不同样品内转录本相关片段进行组装。将3个软件所产生的contigs片段混合，利用cap3软件（http://doua.prabi.fr/software/cap3）对混合片段进一步进行组装，形成更长片段（larger contigs）。利用blastn和blastx将larger contigs与ncbi病毒数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/viruses/）进行比对，综合blastx（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）和blastn（https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/blast.cgi）片段结果，去除非病毒来源片段序列，保留比对片段作为候选基因组来源片段（candiate viurs derived contigs）。整合分析blastn和blastx比对结果时，blastn权重高于blastx，即：blastn和blastx在数据库比对结果矛盾时，以blastn为主。为了充分延伸候选病毒基因组的长度，尽量获取候选太子参病毒基因组完整信息，将所有contigs片段反向匹配到候选病毒基因组起源片段上，将候选病毒基因组片段与匹配片段混合，利用cap3
进一步组装，获取延伸或非延伸的病毒候选基因组片段。如果片段没有延伸，将其去除作为最终获取的病毒基因组片段，如果片段得到了延伸，将延伸病毒基因组片段继续与所有contigs片段进行匹配，重复上述步骤，直到片段不能得到延伸未知。将所有经过充分延伸片段混合收集，作为最终候选太子参病毒来源基因组片段集。利用blastn将片段集再次与ncbi病毒数据库比对，去除病毒集中假阳性片段信息，保留的序列进一步用cd
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hit（http://weizhongli
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lab.org/cdhit _suite/cgi
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bin/index.cgi）去除可能的冗余序列，将最终所获取非冗余序列确证为太子参病毒基因组片段。
18.2. 将上述所获取的病毒片段与ncbi的nt数据库进行比对，比对e值设为1e
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100，抽取出比对结果排列前100的序列。对所获取的序列以此手动检查，滤除可能的非病毒基因组和非全长的病毒基因组序列。利用muscl软件（https://www.ebi.ac.uk/tools/msa/muscle/）对这100序列进行多重比对，根据比对结果，构建出相应病毒基因组末端保守序列区域，并进行截取。将所获取的候选病毒基因组片段与上述构建的末端保守区进行“ping”接触式比较，判定所获取基因组片段是否为相应基因组的全长。如果所获取基因组片段能够代表相应基因组全长信息，将相应片段标记为太子参病毒基因组。
19.3. 采用分段克隆的方法对病毒基因组进行克隆。
20.根据所获的基因组序列，将序列分为两个片段，即p1和p2片段，对2段设计克隆引物：p1段克隆引物：f：agtccagttacgctggagtcaaaaaatataaaaactcaacacaacatacacr:tgtgtgacctattcgcagagcgtgp2段克隆引物：f：ctctgcgaataggtcacacagagaagg；r:atcattcaggacgagcctcagtcccttgcatcctatcaaatgtta以田间病害侵染高发期的太子参总rna为模板，以p1和p2的反向重组引物分别用作反转录反应的特异引物进行特异片段的反转录反应。分别用上述p1段和p2段克隆引物对2部分进行克隆。选择较小的克隆载体psmart来克隆全长候选病毒基因组序列。用特定引物（aaggaggatcaaggcaatgtaatcacctggctcaccttc和gccttgatcctcctttgggccctcatcagagg ttt）将一个dpni限制性酶切位点插入psmart载体中。通过pcr反向扩增线性化修饰的psmart载体。然后，用引物（tgaggctcgtcctgaatgatatc和gactccagcgtaactggactgc）对psmart载体线性化。其次，用dpni消化pcr产物，使用同源重组试剂盒（vayzme, c113
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01/02）将p1、p2和线性化psmart连接到一个完整的载体，用大肠杆菌扩繁后，进行sanger测序，测序结果如seq id no.1所示。
21.3.在psmart
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克隆病毒的基础上，分段克隆所获病毒序列。
22.本发明为了阻滞非病毒核酸序列掺入病毒基因组，利用含有polya和rz（ribozyme）序列的exp
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p1.r引物：gactcgtcagtgtactgatataagtacagactttttttttttttttttttttttttttttttttttttttttgtcccttgcatcctatcaaatgt引物；结合上述克隆引物ctctgcgaataggtcacacagagaagg扩增候选病毒克隆中p2的部分。
23.p1部分使用引物：
exp
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p1:gttcatttcatttggagaggaaaaaatataaaaactcaacacaacatacac和上述克隆引物tgtgtgacctattcgcagagcgtg。
24.产物用dpni酶进行12h消化，以减弱反向扩增后环状质粒带来的假阳性影响。pcr反应混合液中增加dntp用量，反应程序中延长彻底延伸时间，增加长引物扩增中的保真度。为了降低phmv与表达载体连接后片段过大的问题，选择目前表达载体骨架相对较小的pcb301过表达载体为基本骨架，构建phmv侵染克隆的表达载体。
25.使用下列引物对进行反向pcr克隆表达载体pcb301的核心部分，以实现表达载体的线性化。
26.pcb301
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linz
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f：tatcagtacactgacgagtccctaaaggacgaaacggtacccggatgtgttttccgpcb301
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linz
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r：cctctccaaatgaaatgaacttcc使用同源重组将三种纯化的产物即线性化的pcb301， p1（expp1段）和p2（expp2段）连接形成一个完整的、含特定病毒的pcb301
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太子参花叶病病毒表达载体。将上述片段按同源重组试剂盒说明书进行重组连接，采用dh10b大肠杆菌感受态进行转化。
27.4. pcb301
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太子参花叶病病毒表达载体转入gv3101农杆菌，在100μg/ml卡那霉素和50μg/ml利福平的双重抗性条件筛选阳性菌落。具体步骤如下：（1）加入1 μl质粒于gv3101感受态中，冰上静置5 min、液氮冷冻5 min。（2）在37℃水浴锅中复苏5 min，再次在冰上静置5 min。（3） 在无菌条件下加入700 μl
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800 μl无抗性lb到上述感受态细胞内，在28℃，180 rpm条件下孵育2
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3 h。（4）在 5000 rmp条件下离心1 min，取100 μl于（卡那 利福平）上，在28℃条件下倒置培养48 h。（5） 挑取阳性单菌落在，5 ml（lb液体kan rif）28℃、180 rmp条件下摇菌24 h。（6） 取1 ml菌液，在50ml液体lb（kan rif）中放大培养，培养至浓度（od600）达到1.0时，在4000 rpm条件下离心10 min，收集农杆菌的菌体。将上述农杆菌重悬于10 mm mes，ph 5.6、10 mm mgcl2和200 μm as的侵染液内。用去掉针头的注射器，吸取浸染液，采用浸润法注射本氏烟的叶片。具体步骤如下：取容积为 1ml的注射器，移处注射器针头，用手固定住待侵染叶片，用注射器头轻轻摩擦叶片，然后，用力将侵染液体浸润、延展至整个叶片。观察侵染结果发现明显侵染特征。如图2所示，被太子参花叶病病毒克隆感染的本氏烟草的叶子在侵染后第3天开始出现典型的花叶病毒症状；第5天时，新叶中叶片出现卷曲；第12天时叶片边缘向背卷曲且叶脉褪绿；第22天时，植株叶片褪绿更为严重，叶片边缘有明显的扭曲且向背卷曲，而同时期的对照的叶片更光滑（图2）。如图3所示，进一步利用已经克隆的太子参花叶病的病毒基因组的外壳蛋白区域信息，设计一对特异检测引物（f：cacctaatcctatacacgccagag； r：tccatccaagccgaacaaat）。利用这对特异引物对4个被侵染烟草内叶片内的太子参花叶病进行分子检测，结果在4个侵染的本氏烟植株的叶片内均可以清晰的侵染检测出太子参花叶病基因组信息，表明从侵染后第3天开始，太子参花叶病已经成功侵染入了受体植物本氏烟，也侧面的证明了通过本发明所克隆的基因组信息的准确性和有效性（图3）。
28.以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。