一种基于敞开式离子源的甲状腺恶性肿瘤诊断系统的制作方法

1.本技术涉及一种计算机辅助诊断系统，尤其涉及一种基于敞开式离子源的恶性肿瘤诊断系统，特别是 涉及一种基于敞开式离子源的甲状腺恶性肿瘤诊断系统。


背景技术：

2.质谱法(简称质谱)是一种与光谱并列的谱学方法，通常意义上是指广泛应用于各个学科领域中通过制 备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。质谱和光谱、核磁共振等方法是并列关系，目前 很少有交叉领域。实际上，质谱和这些经典谱学方法之间的交叉，也是应该值得重视的研究领域。质谱仪 器一般由样品导入系统、离子源、质量分析器、检测器等部分组成。
3.目前质谱的检测对象主要是有机物和生命活性物质，需要用到一些比较特殊(相对于aes激发源)的电 离源。这些电离源可分为4类，即电子轰击电离(ei)、化学电离(ci)、解吸电离(di)、喷雾电离(si)。除外， 每种电离源都能够同时得到大量的正离子和负离子，而且分子离子的种类跟离子化过程中的媒介或基体有 关。比如，ci能够产生(m h)

、(m nh4)

、(m ag)

、(m cl)—等离子作为分子离子，也能够产生类似 的碎片离子。
4.2004年，首次报道了电喷雾解吸电离(desi)对固体表面进行非破坏性检测的新型质谱分析方法。电喷 雾产生的带电液滴及离子直接打到被分析物的表面，吸附在表面的待测物受到带电离子的撞击从表面解吸 出来并被电离，然后通过质谱仪的采样锥进入质量分析器，获得的质谱图与常规电喷雾质谱图十分相似， 可以得到单个或多个电荷的分子离子。电喷雾解吸电离技术可视为电喷雾技术与解吸技术的结合，而又类 似于二次离子质谱。不同的是，解吸电离技术和二次离子质谱技术都是在真空条件下完成，而电喷雾解吸 电离过程是在大气压环境下完成。由于该方法无须样品预处理，能够对吸附在固体表面的爆炸物、色素、 蛋白质等在大气压下进行离子化，甚至能够对薄层色谱表面的分析物进行直接检测，从而实现了利用质谱 方法进行快速灵敏的测定。是一种新兴的离子源，其最大的优点是能够在大气压下对物质分子进行离子化， 从而实现了对待测物的灵敏、快速、高选择性在线监测。电喷雾解吸电离方法应用广泛，可用于极性化合 物、非极性化合物、高分子量化合物、低分子量化合物的测定。
5.(恶性)肿瘤是人类最常见和最大的杀手。以甲状腺肿瘤为例，其是人体最常见的肿瘤之一。甲状腺 肿瘤主要包括：腺瘤、腺癌、恶性淋巴瘤、原发性肿瘤、转移性肿瘤。其中，腺瘤(adenoma)为腺上皮发生 的良性肿瘤，发育缓慢，形成局限性结节，表面呈息肉状或乳头状。腺癌(thyroidadenocarcinoma)是最常见 的甲状腺恶性肿瘤，有恶性程度较高的未分化癌及恶性程度较低的乳头状腺癌，以及中等恶性程度的滤泡 状腺癌、髓样癌等。初起多元症状，一般局部表现为甲状腺内出现渐进增大的结节、质地硬而固定、表面
6.现代社会中女性甲状腺癌发病率高，男女发病率比例为1：4左右，且发病以青壮年多见。早期甲状 腺癌多无明显症状和体征，通常在体检时通过甲状腺触诊和颈部超声检查而发现甲状腺肿块。随着高分辨 率超声检测技术的普及，甲状腺结节检出的比例越来越
高，并且甲状腺恶性肿瘤的发病率越来越高。但目 前超声分辨率较为低下，无法对甲状腺结节的良恶性进行区分，往往造成甲状腺结节的过度诊疗。
7.目前，有一些专利利用质谱法，对肿瘤比如甲状腺肿瘤的良恶性判定进行了研究和报道。
8.cn111965240a利用甲状腺癌患者和健康人的体液样本与纳米球材料混合，通过基质辅助激光解吸电 离飞行时间质谱(maldi
‑
tof
‑
ms)收集相关体液中的代谢分子信息，利用人工智能的分类算法，区分健康 人和甲状腺癌患者的代谢分子谱差异，并对其差异进行分类。
9.cn111292801a公开了一种蛋白质质谱结合深度学习评估甲状腺结节的方法，包括获取待测甲状腺组 织样本的蛋白质矩阵结果，将该蛋白质矩阵结果输入到深度学习模型中，输出该待测甲状腺组织样本的甲 状腺结节恶性概率。
10.cn104007165a公开了一种筛选甲状腺癌的唾液蛋白质组决策树诊断模型及构建方法，包括以下步骤： 收集甲状腺癌、良性结节性甲状腺肿患者和健康者的唾液，静置、离心处理等，并与np20芯片结合；采 用pbsⅱ型蛋白质芯片阅读仪检测芯片，采用proteinchip software3.2.1分析软件自动采集数据；生物信息 学统计分析。
11.cn104007217a公开了一种筛选甲状腺癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型及其构建方法，该筛选甲状腺 癌血清蛋白质指纹图谱诊断模型的构建方法包括以下步骤：血清样品的收集、处理、保存及与蛋白质芯片 的结合，收集甲状腺癌患者和健康者的血清样本，预处理，并与cm10芯片结合；仪器校正及数据的采集： 采用pbsⅱ型蛋白质芯片阅读仪检测芯片，采用proteinchipsoftware3.2.1分析软件自动采集数据；生物信 息学统计分析，得到筛选甲状腺癌血清早期诊断的特异性蛋白质标记物并构建诊断模型。
12.cn103175935a提供一种用于鉴别乳头状甲状腺癌、良性甲状腺肿和正常人的血液小分子代谢物特征 谱图及其制作方法。所述的小分子代谢物为2个血液代谢标志物，即棕榈酰卡尼汀和卡尼汀，它们的分子 量分别为400.2634和161.20，质谱上检测到的对应离子分别是404.5532和160.7866。
13.kr1020110001647a为早期诊断和预测甲状腺乳头状癌，提供了一种含有3
‑
吲哚乙腈的标记物。组成： 其通过检测生物样品中3
‑
吲哚乙腈的浓度差异来诊断甲状腺乳头状癌。器官样本是血液，血清，垂体液， 唾液，尿液或粪便，通过液相色谱/质谱仪，气相色谱/质谱仪或腱质谱仪检测3
‑
吲哚乙腈浓度的差异。
14.然而，尚未发现关于使用敞开式离子源联用质谱对恶性肿瘤进行辅助诊断的报道。
15.此外，当前机器学习在临床医学诊断领域的应用越来越多，特别是基于包括甲状腺恶性肿瘤等恶性肿 瘤这种高发性疾病的研究越来越多。文献1
‑
文献24列出了诊断甲状腺肿瘤(结节)良恶性判定的机器学 习方法。
16.比如方法学文献1发表在2019年的《lancet oncology》上，通过回顾性、多中心诊断研究，实现了 基于深度学习算法分析超声图像的甲状腺癌良恶性判断方法。
17.比如综述性文献2发表在2017年的《中国癌症杂志》上，系统综述了机器学习在甲状腺肿瘤超声诊 断、细胞学诊断中具有较好的应用。然而，超声和细胞学诊断都是以图像为基础。
18.上述两篇典型文献提出了基于机器学习图像识别技术的甲状腺肿瘤良恶性判定方法。然而，成像方法 是间接观测方法，不能提供直接的、分子水平的证据。
19.比如方法学文献3发表在2020年的预印版平台medrxiv上，运用蛋白质组学技术系统分析了近千例 甲状腺结节病人组织样本的蛋白质组差异，结合人工智能机器学习，鉴定到可区分甲状腺结节良恶性的蛋 白质分子标记物的组合，临床应用准确率达到了90％。然而，蛋白质组学技术需要组织裂解、蛋白提取和 蛋白酶解等步骤，前处理非常复杂。
20.在常规的诊断流程中，对怀疑甲状腺癌的患者行穿刺术，进而通过两个路线进行甲状腺肿瘤的良恶性 判定：一是直接镜下观察；二是经过处理后显微镜下观察。处理过程通常先将穿刺液保存在合适的液基细 胞保存液中，然后通过离心、去上清、清洗、再离心等步骤得到细胞碎屑、红细胞、炎症细胞等干扰成分 少的甲状腺组织细胞。如果通过两种手段仍不能得到有效信息，还需要通过分子病理和临床检验的办法最 终判定肿瘤的良恶性(图1)。
21.超声及超声引导下细针穿刺检查甲状腺结节的良恶性鉴别最常采用的方法。近年来通过机器学习甲状 腺超声图像或者穿刺后细胞学成像的办法，建立了快速甲状腺肿瘤的良恶性的诊断方法，协助病理医生对 甲状腺肿瘤进行快速判定。然而，图像诊断的办法不能够提供直接证据。
22.基于以上方法存在的问题，我们提出基于甲状腺穿刺液样本，进行质谱分析获得穿刺液样本的质谱数 据。基于已知样本建立阳性和阴性样本库，将数据库样本进行统计分析，然后进行机器学习(支持向量机、 随机森林等方法)建立模型。对于未知样本，直接投放到样本库进行区分，设置合理评分阈值，基于评分 阈值给出机器判定结论。
23.文献列表
24.1.li，x.et al.diagnosis of thyroid cancer using deep convolutional neural network models applied to sonographic images:a retrospective，multicohort，diagnostic study.lancet.oncol.20，193
–
201(2019).
25.2.zhang，h.et al.diagnosis of thyroid nodules in ultrasound images using two combined classification modules.in(2020).
26.3.zhu，y.&guo，t.protein classifier for thyroid nodules learned from rapidly acquired proteotypes. (2020).
27.4.陈德华，周东阳&乐嘉锦.基于深度学习的甲状腺结节良恶性预测方法研究.微型机与应用36， 13
–
15(2017).
28.5.冯玉洁，郭燕丽，周喜川，华兴&邓凤莲.基于机器学习的微灶甲状腺乳头状癌超声智能诊断 方法研究.in中国超声医学工程学会第四届全国浅表器官及外周血管超声医学学术会议论文汇编 (2013).
29.6.郭敏&董晓秋.基于深度学习在甲状腺良、恶性肿瘤超声分类中的应用性研究.in中国超声医学工 程学会第二届生殖健康与优生优育超声医学学术大会论文汇编1(2019).
30.7.林雨婷.基于多分类器动态组合的甲状腺结节良恶性预测方法研究.(云南大学，2019).
31.8.马明瑞，马晓剑&冷晓玲.基于机器学习的微灶甲状腺乳头状癌超声智能诊断方
法探析.中国医 疗设备34，171
–
173(2019).
32.9.裴书芳.甲状腺结节多模态超声成像智能化评估模型构建及验证研究.(南方医科大学，2019).
33.10.邱敏.基于人工智能(ai)技术联合甲状腺影像报告与数据系统(ti
‑
rads)分级对甲状腺结节智 能诊断方法研究.(重庆医科大学，2020).
34.11.申星辰.海量甲状腺结节b超图像的诊断分析系统.(北京邮电大学，2019).
35.12.司孟鑫.基于深度学习的肺癌和甲状腺癌医疗影像的研究.(哈尔滨工业大学，2019).
36.13.孙搏浪.基于超声图像的甲状腺结节分割与良恶性分类研究.(电子科技大学，2020).
37.14.王洪杰，于霞&高强.基于深度学习的甲状腺结节自动识别方法在超声图像中的应用.中国医疗 设备34，72
–
74(2019).
38.15.温建鑫.癌症发生的特征基因筛选及模式识别.(北京工业大学，2018).
39.16.吴迪.甲状腺结节诊断分类方法的研究与实现.(东华大学，2017).
40.17.武宽.基于多模态超声影像的甲状腺结节良恶性判别算法研究.(中北大学，2020).
41.18.武宽，秦品乐，柴锐&曾建朝.基于不同超声成像的甲状腺结节良恶性判别.计算机应用040， 77
–
82(2020).
42.19.晏才谷.甲状腺微小乳头状癌中央区淋巴结转移的2种预测模型.(天津医科大学，2020).
43.20.杨创勃et al.基于支持向量机的甲状腺结节能谱研究.中国医学影像学杂志77
‑
80 86(2015).
44.21.易捷伊.机器学习在甲状腺结节良恶性诊断中的辅助分析.(云南大学，2018).
45.22.张婷婷et al.机器学习在甲状腺肿瘤诊疗中的应用.中国癌症杂志27，992
–
995(2017).
46.23.张文丽.深度学习语境下的甲状腺超声辅助诊断app的设计研究.艺术科技30，92(2017).
47.24.邹彤.基于生物组织偏振特性和机器学习的病理图像自动标注.(长春理工大学，2018).


技术实现要素：

48.传统肿瘤良恶性的诊断方法存在诸多共性问题，以甲状腺肿瘤结节为例，其良恶性的诊断方法存在以 下问题：
49.(1)传统甲状腺肿瘤穿刺液样本进行显微镜下观察，需要对样本进行复杂的前处理，并且即使采用 显微镜观察，有时候癌细胞数量不足，仍不能得出可靠的结论。
50.(2)采用机器学习超声图像和细胞学图像辅助诊断甲状腺结节良恶性的办法，虽然经过大量数据积 累后，能很快给病理医生提供辅助证据，但是不能提供直接证据。
51.(3)传统的诊断方法，耗时、耗力。
52.本发明描述的甲状腺结节穿刺液样本，既可以是甲状腺穿刺液、还可以是含穿刺
液样本的专用保存液、 还可以是离心去掉的上清液等部分(图1)。本发明通过原位质谱，直接对甲状腺穿刺液进行质谱分析，不 需要复杂的样品前处理，获得穿刺液样本的质谱扫描数据。基于病理医生细胞学观察实验，给出样本的良 恶性特征后进行分组，然后机器学习，获得模型参数。获得未知样本后，直接用模型进行运算，经过验证 的数据还可以加入到数据库中，作为对数据的补充不断提高数据库的准确性。
53.本发明基于相比于传统的细胞学图像分析，只需要将穿刺液样本加入适当溶剂后进行质谱分析，不需 要复杂的样本前处理，方法简便。通过质谱的快速扫描功能，能够极大地减少分析时间，结合机器学习， 能够快速给出判定结果。
54.本发明相比于传统的超声图像分析，或者基于机器学习的图像分析的手段，通过质谱扫描的方式可以 给出反应恶性甲状腺肿瘤的分子信息，如甲状腺恶性肿瘤的直接证据。
55.因此，本发明具有以下特点：
56.1)分析速度快，对于未知样本，质谱分析和导入模型耗费的时间低于2min。
57.2)样品前处理简便，对于穿刺液加入适当溶剂后，就能够直接采集质谱信息。
58.3)通过质谱分析的手段，能够给出恶性甲状腺结节的特征分子，如甲状腺结节判定的直接证据。极 大的提高诊断效率。
59.4)真正的把原位质谱技术和人工智能用于大量的临床诊断样本。仪器设备简单，可推广性强。
60.此外需要指出，本发明所使用的人工智能模型，例如svm模型(支撑向量机)或随机森林模型，都 是非常成熟的机器学习算法。
61.以支持向量机模型为例，其原理是：求解能够正确划分训练数据集并且 获得几何间隔最大的分离超平面。对于线性可分的数据集来说，这样的超平面有 无穷多个(即感知机)，但是几何间隔最大的分离超平面却是唯一的。
62.以随机森林模型为例，其原理是：决策树是一种树形结构，其中每个内 部节点表示一个属性上的判断，每个分支代表一个判断结果的输出，最后每个叶 节点代表一种分类结果。建立多颗决策树，提高模型准确率，就是随机森林 (random forest)。
63.上述能处理本研究所用数据的算法公式，都属于公知技术，在文献上可查(比如trevor，etc.the elementsof statistical learning：data mining，interence，and prediction)。
64.具体而言，本发明是通过以下技术方案实现的：
65.本发明提供一种基于敞开式离子源的恶性肿瘤诊断系统，其包括以下部分：
66.(s1)、样品前处理试剂盒，所述试剂盒包括有机溶剂；
67.(s2)、敞开式离子源联用质谱设备；
68.(s3)、可选的，计算机模块和处理器，用于构建机器学习模型并获得待测样品结果。
69.本发明还提供一种用于基于敞开式离子源恶性肿瘤诊断的样品前处理方法，其包括以下步骤：
70.1)将穿刺液保存液加入离心管，离心后得上清液；
71.2)取上清液，再次加入盛有有机溶剂的离心管中，离心混匀即得样品。
72.本发明还提供一种非诊断目的的一种基于敞开式离子源的恶性肿瘤分析方法，其包括以下步骤：
73.1)采用上述样品前处理方法获得样品；
74.2)采用敞开式离子源联用质谱设备对所述样品进行测定并输出结果；
75.3)采用计算机模块和处理器对步骤2)获得的结果进行分析，用于构建机器学习模型。
76.本发明还提供敞开式离子源串联质谱仪在制备甲状腺恶性肿瘤的快速诊断产品中的应用。
77.本发明还提供探针电喷雾离子源联用质谱仪在制备诊断甲状腺恶性肿瘤产品中的应用。
78.本发明所述的术语中，恶性肿瘤还可以选自肺癌、乳腺癌、前列腺癌等术前常用穿刺液进行明确诊断 的恶性肿瘤。
79.进一步的，所述试剂盒包括穿刺液和有机溶剂、穿刺液保存液和有机溶剂、或穿刺液保存液的上清液 和有机溶剂。
80.进一步的，穿刺液、穿刺液保存液或穿刺液保存液的上清液与有机溶剂的体积比为1:1
‑
5。
81.进一步的，穿刺液保存液为液基细胞保存液，优选美国bd公司液基细胞保存液。
82.进一步的，有机溶剂为低级醇和c≦10的短链羧酸的组合，其中所述的低级醇优选甲醇、乙醇、丙醇、 异丙醇、丙二醇，最优选乙醇；c≦10的短链羧酸优选甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸，最优选甲酸。
83.进一步的，所述c≦10的短链羧酸占有机溶剂的0.05
‑
10vol％，优选0.1
‑
1vol％，最优选0.35vol％。
84.进一步的，所述的敞开式离子源联用质谱设备为探针电喷雾离子源联用质谱；优选pesi或dcbi。
85.进一步的，所述计算机模块和处理器预置用于处理质谱检测结果的机器学习软件，其支持处理向量机 模型(svm)或者随机森林(rf)模型；优选可商业采购来自日本岛津公司的emsta solution软件。
86.进一步的，探针电喷雾离子源联用质谱预设置的条件为：
87.1)离子源条件：
[0088][0089]
2)质谱条件：
[0090][0091]
此外需要指出，完成本发明所使用的仪器或设备均已上市，本领域技术人员可自由商业采购并使用。
[0092]
例如，液基细胞保存液的主要成分是30vol％以上的乙醇，可采购自美国bd公司。pesi、dcbi、emstasolution软件可采购自岛津公司。
附图说明
[0093]
图1传统的基于甲状腺穿刺液的肿瘤良恶性诊断流程
[0094]
图2基于细胞学或者超声成像和机器学习的甲状腺肿瘤恶性诊断流程
[0095]
图3基于甲状腺穿刺液质谱数据的机器学习的甲状腺肿瘤恶性诊断流程
[0096]
图4正模式质谱条件下的得分图(score plot，a)和负载图(loading plot，b)
[0097]
图5负模式质谱条件下的得分图(score plot，a)和负载图(loading plot，b)
[0098]
图6支持向量机模型参数
[0099]
图7八例阳性样本分组结果和评分
[0100]
图8二十二例阴性样本分组结果和评分
具体实施方式
[0101]
实施例1
[0102]
甲状腺穿刺液前处理方法
[0103]
1)将含穿刺液的20mlbd保存液加入离心管，离心后得上清液；
[0104]
2)取2ml上清液，再次加入盛有2ml乙醇和0.007ml甲酸的离心管中，涡旋混匀即得。
[0105]
实施例2
[0106]
甲状腺穿刺液前处理方法
[0107]
1)将含穿刺液的20ml液基细胞保存液加入离心管，离心后得上清液；
[0108]
2)取1ml上清液，再次加入盛有2ml甲醇和0.01ml乙酸的离心管中，涡旋混匀即得。
[0109]
实施例3
[0110]
甲状腺穿刺液前处理方法
[0111]
1)将含穿刺液的30mlbd保存液加入离心管，离心后得上清液；
[0112]
2)取0.5ml上清液，再次加入盛有2ml丙二醇和0.02ml甲酸的离心管中，涡旋混匀即得。
[0113]
实施例4
[0114]
甲状腺穿刺液前处理方法
[0115]
1)将含穿刺液的40ml液基细胞保存液加入离心管，离心后得上清液；
[0116]
2)取2ml上清液，再次加入盛有4ml乙醇和0.4ml甲酸的离心管中，涡旋混匀即得。
[0117]
实施例5
[0118]
甲状腺穿刺液前处理方法
[0119]
1)将含穿刺液的20mlbd保存液加入离心管，离心后得上清液；
[0120]
2)取1ml上清液，再次加入盛有4ml正戊醇和0.1ml正丁酸的离心管中，涡旋混匀即得。
[0121]
实施例6
[0122]
本实施例以甲状腺穿刺液经液基细胞保存液保存后离心去掉的上清液作为质谱
分析的样本，基于专业 病理医生的诊断结果作为分组依据，进行机器学习模型的构建和模型验证。
[0123]
一、样品前处理方法
[0124]
本实施例阳性样本57例，阴性样本49例，均进行平行试验分析。
[0125]
具体步骤如下：
[0126]
1)含穿刺液样本的18mlbd保存液加入50ml离心管；
[0127]
2)离心后，取0.5ml上清液，加入2ml的离心管中；
[0128]
3)加入1ml乙醇和0.0035ml甲酸，涡旋混匀；
[0129]
4)取9.0μl稀释液进样分析。
[0130]
二、采用的仪器和设备
[0131]
本实施例采用探针电喷雾离子源(dpims)对得到穿刺液样本进行质谱分析。具体离子源条件和质谱 条件如下：
[0132]
1)离子源条件：
[0133][0134][0135]
2)质谱条件：
[0136][0137]
需要说明的是，本发明所述敞开式离子源联用质谱设备具体离子源条件和质谱条件因待检物质、具体 设备提供商、工作机理和环境不同而适应性改变，本领域技术人员和设备提供商均具有根据上述因素调节 改变确定相应离子源条件和质谱条件的能力。
[0138]
三、机器学习模型及模型验证
[0139]
本实施例采用emsta solution(shimadzu)软件，对57例阳性和49例阴性样本(经病理医生通过常 规流程诊断后确认)，共计212例质谱数据，进行分组和机器学习模型的构建。
[0140]
本实施例采用偏最小二乘法
‑
差异分析(pls
‑
da)对已知样本进行分组，采用支持向量机(svm)对 模型数据进行学习，获得模型参数。分组分析的参数设置为，1)把质谱数据进行归一化(bpc)；2)设定 高于基峰强度0.2％的数据参与分组分析。
[0141]
四、分组结果
[0142]
4.1分组结果
[0143]
图4和图5列出了阳性样本(均分布于得分图0
×
100左侧)和阴性样本(均分布于得分图0
×
100右侧) 分别在质谱正模式和负模式采集条件下的分组结果。结果表明pls
‑
da模型能够有效地将样品进行分组。
[0144]
4.2模型评价
[0145]
图6是采用支持向量机模型对212例数据进行学习后，给出的模型参数。
[0146]
随机从样本库中取出8例阳性样本和22例阴性样本验证模型的准确性。图7为编号
范围在 d1075
‑
d1183的8例阳性样本的分组结果和评分。图8位编号范围在d960
‑
d1277的22例阴性样本的分组 结果和评分。阳性和阴性样本的分组结果全部正确。同时，阳性样品的评分在91
‑
92分之间；阴性样品的 评分在92
‑
100分之间。结果表明经过学习后的模型能够很好地对随机样品进行正确分组，并且具有非常高 的可信度。
[0147]
综上，对于总计30个样品，前处理大约10min，质谱分析<30min，软件分析2min，平均每个样品分 析时长小于1.4min，就能够给出判定结果。