一种利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法与流程

本发明属于生物制药领域，尤其涉及一种利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法。

背景技术：

1、生物制药领域中，细胞破碎后的料液含有大量细胞碎片和杂质，需通过固液分离为后续纯化提供清洁进料液。在质粒生产过程中，菌体裂解常采用碱裂解法，即在碱性条件下使宿主细胞的蛋白质、rna和dna释放并变性，加入酸性醋酸钾高盐缓冲液后使变性的宿主dna、蛋白质和破裂细胞壁相互缠绕形成沉淀，加入中和液后质粒dna复性并保持溶解性，再通过添加絮凝剂使杂质进一步絮凝，最后加入nahco3或nh4hco3溶液产生气泡带动沉淀上浮，达到初步固液分离的目的。

2、然而，上述通过添加nahco3或nh4hco3上浮液产生气泡进行固液分离的方案中，气泡生成速度过快且尺寸较大，吸附携带能力不强，且在澄清过滤过程中持续产气影响过滤操作和回收率；静置等待时间长导致目标产物存在降解风险，且需配套冷藏设施增加能耗；上浮液的引入引入了新的工艺杂质并增加料液体积，加大下游处理压力，生产工序复杂成本高；nh4hco3使用过程中产生nh3气体影响环境和操作人员健康安全。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，旨在解决背景技术中存在的问题。

2、本发明是这样实现的，一种的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，包括以下步骤：

3、步骤1：将收集的细胞以p1溶液重悬，得到细胞重悬液。

4、其中，所述p1溶液为含有25mmol/l三羟甲基氨基甲烷（tris）、7.9mmol/l乙二胺四乙酸（edta）和55mmol/l葡萄糖的溶液，ph为7.5±0.2；所述细胞重悬液中细胞含量为5%～25%（w/v）。

5、步骤2：将所述细胞重悬液与p2溶液混合，进行碱裂解反应。

6、其中，所述p2溶液为含有0.2mol/l氢氧化钠（naoh）和1%十二烷基硫酸钠（sds）的裂解液；所述细胞重悬液与p2溶液的混合比例为0.8:1.2～1.2:0.8；碱裂解反应时长为10秒～300秒。混合方式可采用静态混合、搅拌或振荡等混合方式。

7、步骤3：碱裂解反应结束后，将p3溶液与p2溶液混合，进行酸中和以终止碱裂解反应并絮凝部分杂质。

8、其中，所述p3溶液为3mol/l醋酸钾溶液；所述p3溶液与p2溶液的混合比例为0.8:1.2～1.2:0.8；酸中和时长为10秒～300秒。混合方式可采用静态混合、搅拌或振荡等混合方式。

9、步骤4：酸中和结束后，将p4溶液与所述细胞重悬液混合，进行絮凝反应。

10、其中，所述p4溶液为1～5mol/l氯化钙（cacl2）溶液或硫酸锌（znso4）溶液；所述p4溶液与所述细胞重悬液的混合比例为0.5:1.0～1.5:1.0；絮凝反应时长为0.5分钟～60分钟。混合方式可采用搅拌、轨道振荡或波浪式振荡等混合方式。

11、步骤5：向步骤4处理后的料液中引入微纳米气泡，静置，使微纳米气泡吸附絮凝物并带动其上浮，从而在料液上方形成饼状固态杂质分层。

12、其中，微纳米气泡可通过如下任一种方式引入：

13、方式一：使用微纳米气泡发生器向p4溶液中加入微纳米气泡，再将含有微纳米气泡的p4溶液与所述细胞重悬液混合，进行絮凝反应；

14、方式二：使用微纳米气泡发生器向其他缓冲液或水中加入微纳米气泡，再将含有微纳米气泡的其他缓冲液或水加入步骤4处理后的料液中。

15、所述微纳米气泡含量以浊度衡量为1000～20000ntu；所述静置的时间为1分钟～120分钟。

16、步骤6：从步骤5得到的料液的下方相对澄清的料液进行澄清过滤，收集过滤后的澄清料液。

17、其中，所述澄清过滤采用深层膜堆和/或囊式滤器进行过滤；过滤压力小于2bar；所述深层膜堆的孔径为0.1μm～100μm，所述囊式滤器的孔径为0.1μm～0.65μm。过滤结束后，可采用0～5倍滤器死体积的纯化水、注射用水或缓冲溶液作为顶洗液顶洗滤器，将顶洗液合并至收集的澄清料液中。

18、本发明提供的一种利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，具有以下有益效果：

19、本发明通过采用微纳米气泡技术替代传统的nahco3或nh4hco3上浮液化学产气方式，利用微纳米气泡粒径小、比表面积大、上升速度慢、界面电位高的特点，使气泡能够高效吸附携带絮凝物上浮，在料液上方形成紧实的饼状固态杂质分层。

20、本发明取消了上浮液的加入，避免了nahco3、nh4hco3等工艺杂质的引入，减少了上浮液配制和添加等工艺操作流程以及生产等待时间，大幅提高了生产效率；细菌及其裂解后的杂质絮凝物在酸性环境中携带正电荷，而微纳米气泡携带负电荷，气泡在上浮途中更容易吸附絮状沉淀从而促进固液分离，目的产物质粒dna携带负电荷不受其影响；微纳米气泡气浮能力更强、固液分离效果更好，显著降低了澄清过滤的难度和处理压力，节省了相关膜材的使用；取消上浮液加入后工艺体积更小，减少了下游处理压力；通过节省物料、减少设施设备投入、缩短生产等待时间，大幅降低了生产成本；同时，缩短了碱裂解工序到澄清过滤工序的生产等待时间，降低了目标产物降解和质量属性改变的风险，提高了目标产物的产量和质量，且完全避免了因可能使用nh4hco3带来的健康安全隐患。

1.一种利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，所述利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法包括：

2.根据权利要求1所述的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，所述p1溶液为含有浓度为25mmol/l的tris、浓度为7.9mmol/l的edta和浓度为55mmol/l的葡萄糖的溶液，ph为7.5±0.2，所述细胞重悬液中细胞含量为5%～25%；

3.根据权利要求1所述的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，步骤4中所述的微纳米气泡的引入方式为：

4.根据权利要求1所述的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，步骤4中所述的微纳米气泡的引入方式为：

5.根据权利要求1所述的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，步骤4中所述的微纳米气泡含量以浊度衡量为1000～20000ntu，所述静置的时间为1分钟～120分钟。

6.根据权利要求1所述的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，所述澄清过滤采用深层膜堆进行过滤过滤压力小于2bar，所述深层膜堆的孔径为0.1μm～100μm。

7.根据权利要求1所述的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，所述澄清过滤采用囊式滤器进行过滤过滤压力小于2bar，所述囊式滤器的孔径为0.1μm～0.65μm。

8.根据权利要求1所述的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，所述澄清过滤采用深层膜堆和囊式滤器进行过滤过滤压力小于2bar，所述深层膜堆的孔径为0.1μm～100μm，所述囊式滤器的孔径为0.1μm～0.65μm。

9.根据权利要求1所述的利用微纳米气泡技术进行细胞裂解后固液分离的方法，其特征在于，所述澄清过滤结束后，采用0～5倍滤器死体积的纯化水、注射用水、缓冲溶液中的一种作为顶洗液顶洗滤器，并将顶洗液合并至收集的澄清料液中。