一种用于单链DNA建库的微流控芯片系统的制作方法

本发明涉及微流控，具体为一种用于单链dna建库的微流控芯片系统。

背景技术：

1、随着高通量测序技术的普及，dna文库构建成为测序流程中不可或缺的前处理环节。文库构建的主要目的是在目标dna片段的两端添加特定的已知序列接头，以便测序平台能够识别并进行后续的序列扩增和测序读取。

2、现有的常规文库构建流程通常以双链dna作为起始模板并在独立的反应管中进行。操作人员提取样本中的核酸物质并获取双链dna片段后，在反应管中依次加入特定成分的酶混合液，对双链dna片段进行末端修复，随后利用连接酶将双链接头同时连接到dna片段的两端。完成接头连接后，操作人员将流体转移至扩增设备中，通过聚合酶链式反应扩增富集带有接头的目标核酸片段，进而完成整个测序文库的构建。

3、现有以双链dna为模板的常规建库方式在处理降解样本时面临建库转化率低以及易受气溶胶污染的技术缺陷。由于常规操作依赖双链dna的末端修复和双端同时连接机制，这种生化反应路径存在序列偏好性限制，导致高度断裂的降解dna样本以及微量核酸样本难以被有效连接。同时，整个建库生化流程依赖开放的反应管体系、人工频繁移液以及反复开盖加样，操作过程容易引入外部环境中的气溶胶杂质，且手工临时配制各类酶试剂容易导致批次间的反应误差。因此，现有技术缺乏一种能够将单链建库生化逻辑与封闭微流体网络相集成的自动化硬件系统，难以同时解决常规双链连接偏好性限制与人工开放式操作带来的污染及误差问题。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种用于单链dna建库的微流控芯片系统，解决了常规双链dna建库技术在处理高度降解或微量核酸样本时，因末端修复和双端同时连接的序列偏好性导致靶向序列丢失、建库转化率低下，以及因传统开放式人工频繁移液操作引发气溶胶污染和人为批次误差的问题。

2、为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种用于单链dna建库的微流控芯片系统，包括：

3、芯片基体，芯片基体内部设置有多个腔室和微通道； 样本输入口，设置于芯片基体的一端，用于引入dna样本；

4、热变性腔室，通过微通道与样本输入口连通，热变性腔室处配置有第一温控元件；

5、第一连接反应腔室，通过微通道与热变性腔室连通，第一连接反应腔室预装有单链dna连接酶和第一接头的冻干试剂，第一连接反应腔室处配置有第二温控元件；

6、引物延伸腔室，通过微通道与第一连接反应腔室连通，引物延伸腔室预装有dna聚合酶、dntp和延伸引物的冻干试剂，引物延伸腔室处配置有第三温控元件；

7、第二连接反应腔室，通过微通道与引物延伸腔室连通，第二连接反应腔室预装有第二接头和连接酶的冻干试剂；

8、扩增腔室，通过微通道与第二连接反应腔室连通，扩增腔室处配置有第四温控元件；

9、多个微阀，设置于各个微通道中

10、出口，设置于芯片基体的一端，与扩增腔室连通。

11、优选的，芯片基体具有多层键合结构，芯片基体包括依次堆叠的盖片层、通道层以及底片层；盖片层、通道层和底片层之间通过键合工艺固定连接，形成无缝隙连接的整体结构；通道层内部设置有微结构，微结构包括凹槽以及贯穿通道层厚度方向的通孔，通道层与盖片层以及底片层贴合，通道层上的凹槽和通孔被盖片层和底片层封闭，形成封闭的腔体和管路，对应构成芯片基体内部的多个腔室和微通道。

12、优选的，盖片层上设置有贯穿盖片层厚度方向的通孔，盖片层上的通孔对应构成样本输入口和出口；样本输入口与内部的微通道起始端连通，出口为贯穿芯片基体表面的物理通孔且与内部的微通道末端连通，用于供外部流体驱动力推动流体脱离芯片基体。

13、优选的，微阀包含位于微通道上方的可形变薄膜结构；未受外部作用力时，可形变薄膜结构处于平展状态，微通道处于导通状态；外部作用力施加于可形变薄膜结构上方时，可形变薄膜结构发生弯曲形变，发生弯曲形变的薄膜结构贴合在微通道的底壁上，封闭微通道的内部截面，使微通道处于关闭状态。

14、优选的，微通道在芯片基体内部构成单向流体管路，单向流体管路起始于样本输入口，顺次连通各个腔室，终止于出口；单个腔室进行生化反应时，单个腔室前端和后端的微阀均保持关闭状态，使腔室形成封闭的物理空间；生化反应完成后，单个腔室后端的微阀开启，流体进入下一个腔室。

15、优选的，第一温控元件设置于热变性腔室正下方的外部位置，第一温控元件的顶面贴合芯片基体的底面；第一温控元件输出热量，使得热变性腔室内部的流体温度升高并维持在98℃，以使dna样本发生碱基对之间的氢键断裂，解链形成游离于液相缓冲液中的单链dna。

16、优选的，第二温控元件设置于第一连接反应腔室内部或者第一连接反应腔室外部的邻近位置；单链dna连接酶和第一接头的冻干试剂预先固化在第一连接反应腔室的内壁上；第二温控元件将第一连接反应腔室内部流体的温度维持在20℃至30℃的区间内，液相缓冲液溶解固化的冻干试剂，单链dna连接酶发生催化作用，催化单链dna的末端与第一接头发生共价结合。

17、优选的，dna聚合酶、dntp和延伸引物的冻干试剂预先固化在引物延伸腔室的内壁上；第三温控元件将引物延伸腔室内部流体的温度维持在37℃至50℃的区间内，液相缓冲液溶解固化的冻干试剂，延伸引物与单链dna上的第一接头序列发生碱基互补配对结合，dna聚合酶以单链dna为模板利用流体中的dntp合成互补链，将单链dna转化为双链dna结构。

18、优选的，第二接头和连接酶的冻干试剂预先固化在第二连接反应腔室的内壁上；液相缓冲液溶解固化的冻干试剂，连接酶在流体内部发生催化作用，催化第二接头与双链dna未连接接头的另一端发生共价结合，使双链dna的两端分别接入第一接头和第二接头，形成带有双端接头的建库中间产物。

19、优选的，第四温控元件设置于扩增腔室下方的外部位置，第四温控元件的表面贴合芯片基体的底面；第四温控元件执行聚合酶链式反应所需的温度循环程序，温度循环程序控制扩增腔室内部流体经历变性、退火和延伸的周期性温度交替，带有双端接头的建库中间产物在周期性的温度交替条件下发生靶向富集，生成最终的建库产物。

20、本发明提供了一种用于单链dna建库的微流控芯片系统。具备以下有益效果：

21、1、本发明通过在微流控芯片基体内部设置热变性腔室和反应腔室并配置独立的第一至第四温控元件，先将样本解链为单链dna再顺次流经第一连接反应腔室和引物延伸腔室进行分步的单端接头共价结合与互补链合成操作，规避了常规双链建库末端修复和双端同时连接过程中的偏好性限制，实现了针对高度断裂降解样本以及极微量核酸样本的建库转化率有效提升的技术效果。

22、2、本发明通过采用多层键合工艺构建单向流体管路并将发生不同生化反应的多个腔室串联在多层键合芯片基体的封闭网络内部，配合设置在微通道上的可形变薄膜结构微阀按照设定时序依次封闭内部截面或恢复导通状态，替代传统建库操作中移液器加样以及开盖步骤并隔离各个独立的生化反应区域，实现了切断外部气溶胶污染dna样本物理途径并保证建库产物纯净度的效果。

23、3、本发明通过在第一连接反应腔室、引物延伸腔室和第二连接反应腔室的内壁上预先固化包含连接酶、聚合酶与接头成分的冻干试剂，依靠单向流体管路引导上一步反应输出的样本携带液相缓冲液进入当前封闭物理空间后直接完成生化反应物质的复溶动作，免去人工配制试剂流程并利用微通道网络自动化引导流体流转，实现了单链建库催化体系稳定运行并降低批次间误差的效果。