一种硬毛粗盖孔菌的培养方法

本发明涉及微生物，尤其涉及一种硬毛粗盖孔菌的培养方法。

背景技术：

1、硬毛粗盖孔菌（coriolopsistrogii）为担子菌门多孔菌科耐热白腐真菌，天然腐生于温带、亚热带阔叶枯木，是森林木质残体核心降解微生物。该菌株兼具药用与环境双重开发价值：其子实体含多糖、多酚等活性物质，具备抗氧化、保肝、免疫调节、抗肿瘤功效；菌丝可分泌多种木质纤维素降解酶，能高效分解木质素，用于染料废水脱色、重金属离子吸附、农林废弃物资源化利用。

2、现有技术存在四大关键缺陷：

3、（1）缺少国内本土野生鉴定菌株，现有菌种多引进、菌丝生长速度慢、产漆酶能力弱；暂无完整形态+its双重鉴定的本地稳定菌株资源；

4、（2）传统pda、通用基础培养基营养配比粗放，碳、氮、无机盐未协同优化，单一营养浓度过高/过低均抑制菌丝；现有研究常添加外源维生素，反而降低菌丝生长速率，提升原料成本；

5、（3）现有研究仅单独探究单一碳源或氮源影响，未采用五因素box-behnken响应面多因子耦合优化，无精准可规模化的标准化母种配方；

6、（4）未系统同步测定木质素、纤维素、半纤维素全套8种关键降解酶的时序活性，无法根据培养时间定向富集高活性漆酶等功能酶，限制产业化酶制剂、环境修复材料开发。

技术实现思路

1、为了解决上述问题，本发明提供了一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，来解决该问题。

2、为达到上述目的，本申请提供如下技术方案：

3、一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，s1：将硬毛粗盖孔菌株接种至pda活化平板，25℃恒温避光培养5～7d获得纯化活化菌丝；

4、s2：制备培养基，灭菌冷却后备用；

5、s3：将活化菌丝接种至培养基中心后进行恒温培育，获得硬毛粗盖孔菌。

6、所述硬毛粗盖孔菌采集自天津农学院东校区阔叶树腐木野生子实体；采用组织分离法纯化；经形态学结合its分子鉴定，its序列全长544bp，25℃平板培养条件下菌落呈规则圆形，致密白色棉絮状，均匀辐射向外生长，无色素分泌。

7、s1中，所述pda活化平板的配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1l。

8、s2中，所述培养基以每升蒸馏水计，包含如下组分：葡萄糖19.49g、酵母粉14.48g、蛋白胨5.18g、硫酸镁0.596g、磷酸二氢钾0.607g、琼脂18～22g；培养基自然ph为5.5～6.5。

9、s2中，所述培养基灭菌条件为：121℃蒸汽灭菌20min。

10、s3中，所述恒温培育的条件为：25℃全程避光静置培养。

11、一种硬毛粗盖孔菌复合粗酶液的制备方法，采用所述的培养方法获得菌丝制备，其特征在于，包括以下步骤：

12、步骤a：收集硬毛粗盖孔菌丝置于离心管，液氮冷冻充分研磨破碎；

13、步骤b：按菌丝：去离子水料液比1:10混合获得混合溶液；

14、步骤c：将混合溶液以10000r/min，离心10min取上清液即为复合粗酶液。

15、所述复合粗酶包含：木质素酶、纤维素酶与半纤维素酶。

16、复合粗酶液应用于农林木质纤维素降解、印染废水脱色、重金属水体修复、药用真菌多糖发酵、白腐真菌降解酶制剂生产中。

17、相比于现有技术，本发明的有益技术效果为：

18、1、菌种优势突出：本土野生耐热菌株，漆酶产量显著高于现有商用菌株，双重鉴定分类准确，4℃冷藏保藏遗传稳定，适配北方栽培环境；

19、2、培养基优化增益明显：采用5因素响应面精准耦合优化，回归模型r²=0.9906，失拟项无显著差异，预测与实测相对误差仅0.23%，配方精准可靠；明确葡萄糖、酵母粉、复合无机盐为核心促生长组分，证实vb1/vb2/vb6全部抑制菌丝，省去维生素原料，降低生产成本；最优配方下菌丝生长速率远高于传统pda基础培养基，菌落致密均匀，不易老化退化；

20、3、培养工艺简易规模化：全程仅需25℃恒温避光，无需变温、特殊发酵设备，食用菌菌种厂可批量生产母种；

21、4、完整酶活时序数据支撑定向产酶：首次同步测定8种降解酶动态变化，漆酶7d活性最高，纤维素酶5d达到峰值，半纤维素酶前期活性最优，可根据需求精准控制培养时间富集目标酶；

22、5、应用场景广泛：一套技术同时覆盖菌种繁育、降解酶制备、印染废水脱色、重金属吸附、农林秸秆生物转化、药用多糖发酵，产业化价值高。

1.一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，其特征在于，包括：s1：将硬毛粗盖孔菌株接种至pda活化平板，25℃恒温避光培养5～7d获得纯化活化菌丝；s2：制备培养基，灭菌冷却后备用；s3：将活化菌丝接种至培养基中心后进行恒温培育，获得硬毛粗盖孔菌。

2.根据权利要求1所述的一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，其特征在于，所述硬毛粗盖孔菌采集自天津农学院东校区阔叶树腐木野生子实体；采用组织分离法纯化；经形态学结合its分子鉴定，its序列全长544bp，25℃平板培养条件下菌落呈规则圆形，致密白色棉絮状，均匀辐射向外生长，无色素分泌。

3.根据权利要求1所述的一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，其特征在于，s1中，所述pda活化平板的配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、蒸馏水1l。

4.根据权利要求1所述的一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，其特征在于，s2中，所述培养基以每升蒸馏水计，包含如下组分：葡萄糖19.49g、酵母粉14.48g、蛋白胨5.18g、硫酸镁0.596g、磷酸二氢钾0.607g、琼脂18～22g；培养基自然ph为5.5～6.5。

5.根据权利要求1所述的一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，其特征在于，s2中，所述培养基灭菌条件为：121℃蒸汽灭菌20min。

6.根据权利要求1所述的一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，其特征在于，s3中，所述恒温培育的条件为：25℃全程避光静置培养。

7.一种硬毛粗盖孔菌复合粗酶液的制备方法，采用权利要求1-5任一项所述的培养方法获得菌丝制备，其特征在于，包括以下步骤：步骤a：收集硬毛粗盖孔菌丝置于离心管，液氮冷冻充分研磨破碎；步骤b：按菌丝：去离子水料液比1:10混合获得混合溶液；步骤c：将混合溶液以10000r/min，离心10min取上清液即为复合粗酶液。

8.根据权利要求6所述的一种硬毛粗盖孔菌的培养方法，其特征在于，所述复合粗酶包含：木质素酶、纤维素酶与半纤维素酶。

9.一种权利要求7所述的复合粗酶液在农林木质纤维素降解、印染废水脱色、重金属水体修复、药用真菌多糖发酵、白腐真菌降解酶制剂生产中的应用。