含羟基氨基酸的低毒广谱抗菌肽及其应用

本发明属于生物化学，具体涉及含羟基氨基酸的新型低毒广谱抗菌肽，本发明同时还涉及所述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

背景技术：

1、传统抗生素在治疗传染性疾病中发挥了重要作用，但其广泛滥用导致了耐药细菌的不断出现，抗微生物耐药性在全球范围内迅速上升，严重威胁公众健康。尤其是耐多药菌株的出现，给临床治疗带来了巨大挑战（bangladesh medical research councilbulletin, 2021, 47: 101–102）。因此，亟需开发新型抗菌策略以突破现有抗菌药物的局限性。

2、抗菌肽（amps）作为生物体先天免疫防御系统的关键组成部分，其核心作用机制在于利用自身的阳离子特性和两亲性结构，通过静电引力优先识别并结合带负电荷的细菌细胞膜，进而通过物理方式破坏膜的完整性，这一过程不依赖于与特定蛋白质靶点的相互作用，因此细菌难以通过简单突变产生耐药性（the european physical journal: specialtopics, 2024, 233: 2981–2996）。此外，抗菌肽具有广谱、快速杀菌的特性，对包括耐多药细菌在内的多种病原体均表现出显著活性。这些优势使其成为新型抗生素领域极具潜力的候选分子（molecules2025, 30: 1529）。

3、然而，天然及传统设计的抗菌肽常存在溶血活性高、细胞毒性大、体内稳定性差等缺陷，限制了临床应用（military medical research, 2021, 8: 48）。因此，亟需建立一种系统化的序列工程设计策略，实现高活性、低毒性、高稳定性的平衡。研究表明，抗菌肽的生物活性与其净电荷、疏水性、两亲性等理化参数密切相关，通过序列工程精细调控上述参数是实现高活性与低毒性平衡的关键（internationaljournal of molecular sciences,2024, 25: 10821）。其中，引入羟基氨基酸（如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）可有效调节肽的亲水性与生物相容性，而引入d-型氨基酸可提高多肽的体内稳定性（acs omega, 2024, 9:26030−26049; acta biochimica et biophysica sinica, 2017, 49(10): 916–925）。基于此，申请人设计了一种含羟基氨基酸的新型低毒广谱抗菌肽，并进一步制备其d-型对映体，以期获得高活性、低毒性、高稳定性的抗菌肽。

技术实现思路

1、本发明的目的之一是提供一种含羟基氨基酸的低毒广谱抗菌肽。

2、本发明的目的之二是提供上述抗菌肽的d-型对映体。

3、本发明的目的之三是提供上述抗菌肽在制备抗菌药物中的应用。

4、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

5、（一）一种含羟基氨基酸的低毒广谱抗菌肽的设计

6、本发明首先提供了一类基于全亮氨酸骨架从头设计的抗菌肽。该系列抗菌肽的氨基酸序列总长度为10个氨基酸，基础骨架结构为全亮氨酸线性序列。在结构上，将序列的第1、4、5、8、9位设定为亲水面，其余位置（第2、3、6、7、10位）为疏水面。

7、具体设计规则如下：

8、1. 亲水面引入羟基氨基酸（苏氨酸、丝氨酸或酪氨酸），数量为1~3个，亲水面中赖氨酸的数量为2~4个，且满足以下搭配：

9、羟基氨基酸为1个时，赖氨酸可为2、3或4个；羟基氨基酸为2个时，赖氨酸可为2或3个；羟基氨基酸为3个时，赖氨酸为2个；亲水面中除羟基氨基酸和赖氨酸外的剩余位置由组氨酸填充；

10、2. 疏水面的氨基酸组成根据亲水面赖氨酸数量动态调整：

11、赖氨酸为2个时，疏水面全为亮氨酸；赖氨酸为3个时，疏水面引入1个色氨酸，其余为亮氨酸；赖氨酸为4个时，疏水面引入3个色氨酸，其余为亮氨酸；

12、整体疏水性（h）通过heliquest网站进行计算，本发明设定设计阈值h ≥ 0.6。

13、基于上述规则，共设计获得27条候选肽。

14、（二）优选抗菌肽及其d-型对映体

15、经体外抗菌活性及毒性筛选（筛选标准：对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌的最小抑菌浓度mic ≤ 16 μm，且引起小鼠红细胞10%的溶血的药物浓度≥100 μm），获得一条优选抗菌肽，命名为肽21，其氨基酸序列为：lys-trp-leu-lys-lys-trp-trp-tyr-lys-leu-nh2（seq id no.1）。

16、为进一步提高抗菌肽的体内稳定性，本发明提供了肽21的全d-型对映体，命名为d-21，其氨基酸序列为：d-lys-d-trp-d-leu-d-lys-d-lys-d-trp-d-trp-d-tyr-d-lys-d-leu-nh2。

17、（三）抗菌肽的合成

18、本发明所述的抗菌肽采用经典的多肽fmoc固相合成方法合成。以rink amidembha树脂为原料，从肽链c端向n端依次偶联相应的fmoc-保护氨基酸（合成d-21时使用fmoc-d-型氨基酸）。偶联试剂为hbtu/hobt/diea体系，采用茚三酮显色法检定二级胺。多肽合成完成后，以切割试剂（tfa:tis:h2o=95:2.5:2.5）将肽从树脂上切割下来，经乙醚沉淀、冷冻干燥得粗肽，最后通过反相高效液相色谱纯化，得到纯度 ≥ 95%的目标抗菌肽。

19、（四）含羟基氨基酸的低毒广谱抗菌肽在制备抗菌药物中的应用

20、1. 体外抑菌实验

21、采用微量肉汤稀释法测定抗菌肽对革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、枯草芽孢杆菌）和革兰氏阴性菌（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌）的最小抑菌浓度（mic）。以polymyxin b和vancomycin作为阳性对照，实验平行重复三次，结果如表1所示。

22、表1本发明抗菌肽对常见标准菌株的最低抑菌浓度

23、

24、表1结果显示，本发明的抗菌肽21及其d型异构体d-21对测试的所有革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出强效的抑制作用，最小抑菌浓度在2-16 μm范围内，具有广谱抗菌活性。

25、2. 溶血活性实验

26、为了评价本发明合成的抗菌肽对哺乳动物红细胞的毒性，采集小鼠新鲜抗凝血，制备8%红细胞悬液，与不同浓度（1-256 μm）的抗菌肽于37 ℃孵育1小时，测定490 nm吸光度，计算溶血率。以1% triton x-100为阳性对照（100%溶血），pbs为阴性对照（0%溶血），结果见图3。

27、图3结果显示，即使在256 μm的浓度下，肽21和d-21对小鼠红细胞的溶血率均低于5%，显示出极低的溶血毒性，具有良好的生物相容性。

28、3. 血清稳定性实验

29、为了考察本发明的抗菌肽在小鼠血清中的稳定性，利用rp-hplc分别监测肽21和d-21与小鼠血清（10%血清和100%血清）在37 ℃共孵育后在不同时间点的降解情况，并计算血清半衰期，结果见图4和图5。

30、图4和图5结果显示，肽21在10%血清中的半衰期为14.49 h，在100%血清中的半衰期为2.44 h。与l-型肽21相比，全d-型抗菌肽d-21在10%血清和100%血清中的半衰期均大于24 h，显著优于l-型肽，表现出优异的血清稳定性。

31、4. 诱导耐药实验

32、为了考察本发明合成的抗菌肽是否会诱导细菌产生耐药性，对抗菌肽21和d-21与金黄色葡萄球菌atcc 25923及大肠杆菌 atcc 25922连续作用20天后的诱导耐药情况进行测定，以抗生素rifampin、gentamicin、vancomycin、polymyxin b作为对照，结果见图6和图7。

33、图6结果显示，抗菌肽21和d-21与金黄色葡萄球菌atcc 25923连续作用20天后均没有产生耐药性，rifampin和gentamicin迅速产生耐药性，rifampin在20天后mic提高了4096倍，gentamicin在20天后mic提高了1024倍。图7结果显示，抗菌肽21和d-21与大肠杆菌atcc 25922连续作用20天后均没有产生耐药性，rifampin和gentamicin迅速产生耐药性，在20天后mic提高了128倍。诱导耐药实验结果表明，与临床常用抗生素利福平和庆大霉素相比，肽21及d-21在与金黄色葡萄球菌或大肠杆菌连续作用20天后，mic值无明显变化（变化倍数<4倍），表明本发明的抗菌肽不易诱导细菌产生耐药性。

34、5、小鼠体内急性毒性实验

35、实验小鼠为balb/c小鼠，雄性，18-22g，根据兰州大学实验动物伦理学管理办法饲喂。

36、急性毒性半数致死量ld50预实验：每组3只，腹腔一次性注射用生理盐水溶解的抗菌肽21和d-21，7天内观察死亡情况，用polymyxin b作对照，探索引起100%死亡的最小剂量和0%死亡的最大剂量，确定剂量上下限。

37、急性毒性半数致死量ld50正式实验：根据预实验，我们测得肽21的ld50剂量范围为60-120 mg/kg，肽d-21的ld50剂量范围为30-70 mg/kg，对照药polymyxin b的剂量范围为15-20 mg/kg。因此我们根据肽21的剂量范围计算出其分组的公比为1.4142，将其分为3组，分别是60，84.8，120 mg/kg。肽d-21的分组的公比为1.5275，将其分为3组，分别是30，45.8，70 mg/kg。对照药polymyxin b的分组的公比为1.1547，将其分为3组，分别是15，17.3，20mg/kg，分别进行接下来的正式实验。根据分组，我们对各组小鼠腹腔一次注射相应剂量的肽21、d-21或polymyxin b，7天内观察死亡情况，计算ld50。结果见表2、图8、图9和图10。

38、表2本发明抗菌肽和polymyxin b对balb/c小鼠的ld50

39、

40、图8的结果显示，给小鼠腹腔注射120 mg/kg的肽21后，在2天内10只小鼠全部死亡，死亡率为100%。给小鼠腹腔注射84.8 mg/kg的肽21后，在7天内，10只小鼠中有4只死亡，死亡率为40%。给小鼠腹腔注射60 mg/kg的肽21后，7天内小鼠全部存活。图9的结果显示，给小鼠腹腔注射70 mg/kg的肽d-21后，在2天内10只小鼠全部死亡，死亡率为100%。给小鼠腹腔注射45.8 mg/kg的肽d-21后，在7天内，10只小鼠中有5只死亡，死亡率为50%。给小鼠腹腔注射30 mg/kg的肽d-21后，7天内10只小鼠中有1只死亡，死亡率为10%。图10的结果显示，给小鼠腹腔注射20 mg/kg的对照药polymyxinb后，在20 min内10只小鼠全部死亡，死亡率为100%。给小鼠腹腔注射17.3 mg/kg的对照药polymyxin b后，在7天内，10只小鼠中有5只死亡，死亡率为50%。给小鼠腹腔注射15 mg/kg的对照药polymyxin b后，7天内10只小鼠中有2只死亡，死亡率为20%。表2的结果显示了经过计算后，本发明抗菌肽21、d-21和对照药polymyxin b对balb/c小鼠体内急性毒性实验的ld50值，本发明抗菌肽21的ld50值约为对照药polymyxin b的5.25倍，本发明抗菌肽d-21的ld50值约为对照药polymyxin b的2.60倍，结果表明本发明抗菌肽与对照药polymyxinb相比，在小鼠体内具有更高的安全性。

41、从以上实验及数据可以看出，本发明提供的含羟基氨基酸的低毒广谱抗菌肽在制备预防或治疗细菌感染药物中的应用中，所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌。

42、进一步地，本发明提供的含羟基氨基酸的低毒广谱抗菌肽可制备用于治疗细菌耐药性感染的药物。

43、同时，基于以上实验数据，本发明还提供了一种预防或治疗细菌感染的药物组合物或药物制剂，所述药物组合物或药物制剂包括本发明所述肽21或d-21，以及药学上可适用的辅料；所述细菌为革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌；所述药物制剂优选为注射液。

44、综上所述，本发明提供了一种含羟基氨基酸的低毒广谱抗菌肽肽21及其全d-型对映体d-21。体外抑菌实验表明，本发明的抗菌肽对革兰氏阳性菌和阴性菌具有广谱抗菌活性，同时具备极低的溶血毒性及不易诱导耐药的特点。体内急性毒性实验结果表明，本发明抗菌肽21、d-21与对照药物polymyxin b相比，具有更高的体内安全性。因此，本发明的抗菌肽可应用于制备临床抗菌药物。