山茶籽油酶解物作为氮源在灵芝液体发酵中提高灵芝菌丝体中三萜类化合物产量中的应用的制作方法

本技术涉及药用真菌深层液体发酵培养，尤其涉及山茶籽油酶解物作为氮源在灵芝液体发酵中提高灵芝菌丝体中三萜类化合物产量中的应用。

背景技术：

1、灵芝（

ganoderma spp.）是珍稀的食药用真菌，富含多种生物活性成分。灵芝中所含的活性物质主要包括多糖类、三萜类、核苷类、甾醇类、生物碱类、氨基酸多肽类等，其中，灵芝多糖和三萜是灵芝最主要的生物活性成分，也是评价灵芝质量的重要指标。三萜类化合物具有抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等多种药理活性，是灵芝药用价值的重要物质基础。

2、与灵芝子实体和孢子粉相比，灵芝菌丝中所含的活性物质活性更高，并且液体发酵具有发酵时间短、污染可能性小等优点，更有利于菌丝的工业化生产。现阶段灵芝液体发酵配方中，碳源多采用蔗糖、玉米粉等，氮源多采用酵母粉、豆饼粉、蛋白胨等。以蔗糖为碳源时虽原料成本较低，但三萜产量普遍偏低。常规氮源则存在以下不足：（1）价格昂贵，增加了发酵生产成本；（2）营养成分单一，缺乏对灵芝次级代谢途径的特异性促进作用；（3）三萜类化合物作为灵芝主要的药用活性成分，其产量普遍不高，限制了灵芝菌丝产品的品质和附加值。

3、为提升三萜产量，现有技术中有采用麦芽汁替代常规碳源的研究。申请公布号为cn104878065a的发明专利申请公开了一种灵芝菌株液体发酵生产灵芝三萜的方法，该方法以麦芽汁为碳源、酵母浸出粉为氮源进行灵芝液体发酵，经响应面优化后胞内三萜产量最高可达约93.21 mg/100ml。然而，上述方法仍存在以下技术缺陷：（1）采用酵母浸出粉作为氮源，成本较高；（2）麦芽汁的制备需要糖化处理，工艺复杂。也即，该专利技术方案中碳源和氮源均不利于工业化生产的经济性。

4、油茶饼粕（亦称山茶籽粕、茶籽饼）是油茶（

camellia oleifera abel.）籽榨油后的主要副产物。现有研究表明，油茶饼粕富含蛋白质（含量约10%～16%）、茶籽多糖（含量5%～15%）和茶皂素（含量10%～15%）等成分。油茶饼粕蛋白含有17种氨基酸，其中包含多种必需氨基酸。然而，由于油茶饼粕中含有溶血性茶皂素等抗营养因子，其直接作为饲料或发酵原料的应用受到限制。目前，尚未见将山茶籽加工副产物经特定酶解工艺处理后用作灵芝液体发酵氮源的相关报道。

技术实现思路

1、针对现有灵芝液体发酵中氮源成本高、碳源制备工艺复杂以及三萜产量偏低的技术缺陷，本发明提供山茶籽油酶解物作为氮源在灵芝液体发酵中提高灵芝菌丝体中三萜类化合物产量中的应用。本发明通过对山茶籽榨油副产物油渣进行脱脂、碱预处理及复合酶解，制备得到富含小分子肽、游离氨基酸和可溶性糖类的山茶籽油酶解物，将其作为灵芝液体发酵的氮源，可显著提高灵芝菌丝体中三萜类化合物的产量。

2、山茶籽油酶解物作为氮源在灵芝液体发酵中提高灵芝菌丝体中三萜类化合物产量中的应用，所述山茶籽油酶解物的制备工艺如下：

3、1）干燥粉碎：山茶压榨副产物油渣60～80°c烘干至原料水分≤10%，粉碎后过40目筛，得到油渣粗粉；

4、2）有机溶剂脱脂：正己烷料液比1:4～1:6（g/ml）室温浸泡脱脂，搅拌2～4 h，重复2～3次，回收有机溶剂后70～80°c烘干0.5～1 h，制得脱脂油渣粉；

5、3）碱法预处理：1 wt%氢氧化钠溶液浸泡脱脂油渣粉，室温1～2 h，水洗中和至中性后干燥备用；

6、4）复合酶解：经步骤3）处理的脱脂油渣粉添加4～6倍质量去离子水配成悬浮液，柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液调节ph 4.5～5.5；添加油渣粉质量2%的纤维素酶+半纤维素酶（酶活配比1:1）复合酶制剂，50～55°c水浴搅拌酶解6～10 h；酶解完毕80～90°c水浴保温灭酶，过滤，滤液浓缩即为山茶籽油酶解物。

7、优选地，所述应用包括以下步骤：

8、（1）菌种活化扩培制备种子液：将斜面活化后的灵芝菌种接种于种子液体培养基，摇床振荡培养制备一级菌种液；

9、（2）深层液体发酵培养：将步骤（1）所得一级菌种液按设定接种量接入发酵液体培养基，恒温摇床发酵培养6～8天，收获富含三萜类化合物的灵芝菌丝发酵产物；

10、所述发酵液体培养基包含以下组分：蔗糖25～35 g/l、山茶籽油酶解物3.0～7.0g/l、磷酸二氢钾2.0～3.0 g/l、硫酸镁0.5～1.5 g/l；培养基ph自然。

11、优选地，所述发酵液体培养基的配方为：蔗糖30.0 g/l、山茶籽油酶解物4.8 g/l、磷酸二氢钾2.5 g/l、硫酸镁0.5 g/l，ph自然。

12、优选地，步骤（2）中菌种液接种量体积分数为15%～25%（v/v）。

13、优选地，步骤（2）恒温摇床发酵培养条件为：培养温度25°c、振荡转速160 rpm。

14、优选地，步骤（1）种子液培养条件为：25°c、160 rpm震荡培养6 d。

15、优选地，所述菌种为西藏灵芝（

ganoderma leucocontextum）gdrk-02，保藏编号cctcc no:m 20261045。

16、本技术的作用机理：

17、山茶籽油酶解物是山茶籽榨油副产物油渣经脱脂、碱预处理及复合酶解后所得的酶解液浓缩物。油茶饼粕富含蛋白质（含量约10%～16%）、茶籽多糖（含量5%～15%）和茶皂素（含量10%～15%）等成分。经复合酶解后，大分子蛋白质被降解为小分子肽和游离氨基酸，多糖部分被降解为可溶性寡糖和单糖。因此，山茶籽油酶解物中富含小分子有机氮源（小肽、游离氨基酸）和可溶性碳源（寡糖、单糖），能够直接被灵芝菌丝吸收利用。

18、灵芝三萜类化合物通过甲羟戊酸（mva）途径合成：从乙酰辅酶a出发，经过法呢酯焦磷酸、鲨烯、鲨烯-2,3-氧化物和羊毛甾醇等中间体，最后经过一系列氧化还原及环化反应形成三萜类化合物。山茶籽油酶解物作为氮源促进三萜合成的机制包括：

19、（1）氨基酸组成优势：山茶籽蛋白中有效赖氨酸和含硫氨基酸（半胱氨酸、蛋氨酸）含量较高。含硫氨基酸可为灵芝次级代谢提供充足的甲基供体——s-腺苷甲硫氨酸（sam），促进三萜类化合物的合成。sam是甲羟戊酸途径中多个甲基化反应的关键甲基供体，充足的sam供给可显著提高三萜合成的效率。

20、（2）小分子肽的快速利用：酶解产生的小分子肽可被灵芝菌丝快速吸收，促进菌丝前期快速生长，为次级代谢积累充足的菌丝生物量。菌丝生物量的增加为三萜类化合物的合成提供了更多的细胞工厂。

21、（3）碳氮协同供给：酶解物中的可溶性糖类可作为补充碳源，与蔗糖形成“快速+缓释”的双重碳源供给模式，优化培养基碳氮比，促进菌丝生长和代谢活力。

22、因此，山茶籽油酶解物替代传统氮源，通过“前体供给+快速生长+碳氮优化”的多重机制，能够同时满足菌丝快速生长和次级代谢启动的双重营养需求，从而显著提高灵芝菌丝体中三萜类化合物的产量。

23、本技术的有益效果是：

24、1. 本发明利用山茶籽榨油副产物经特定酶解工艺制备山茶籽油酶解物，替代传统氮源（酵母粉、蛋白胨、豆饼粉等），不仅大幅降低了原料成本，而且能够显著提升灵芝菌丝体中三萜类化合物的产量。在等氮量条件下，山茶籽油酶解物的三萜产量较酵母粉提高10.8%，较蛋白胨提高18.9%，较豆饼粉提高14.8%，较牛肉膏提高29.6%。进一步通过响应面优化，三萜产量最高可达92.57 mg/100ml。更重要的是，本发明采用蔗糖（大宗商品，价格低廉）和山茶籽油酶解物（农副产品副产物），原料成本远低于现有技术中的麦芽汁和酵母浸出粉。

25、2. 山茶籽油酶解物的原料为山茶籽压榨加工副产物，来源广泛、价格低廉。本发明通过特定工艺将其制备为高效氮源，实现了农业副产物的高值化利用。

26、3、现有技术中普遍认为葡萄糖是灵芝液体发酵的最适碳源，本发明将蔗糖与山茶籽油酶解物配合用于灵芝三萜的高效生产。实验表明，蔗糖与山茶籽油酶解物的配合效果显著优于葡萄糖与山茶籽油酶解物的配合。