UV-B诱导型桑树转录因子NAC和TIFY及其在调控黄酮中的应用

本发明涉及植物基因工程，尤其是一种uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify及其在调控黄酮中的应用。

背景技术：

1、桑树（

morus）是我国传统重要的经济与药食同源资源作物，其叶片富含类黄酮、生物碱、花青素、多糖等次生代谢产物，具备抗糖尿病、抗氧化、抗炎、抗衰老等健康功效，在功能性食品、医药等领域应用价值显著。

2、紫外-b（uv-b，波长280-320nm）是调控植物次生代谢的关键环境因子，低剂量uv-b补光可有效提升植物黄酮类物质含量。现有技术已证实低剂量uv-b处理药桑可显著上调黄酮类物质含量，但uv-b信号如何被感知并转导至黄酮合成通路、核心转录调控节点是什么，至今尚不明确，这直接导致缺乏可直接用于基因工程改良的关键基因资源，限制了桑树黄酮合成的定向调控与高黄酮桑树品种的培育。

3、转录因子是调控植物次生代谢通路的核心元件，nac与tify是植物中重要的转录因子家族，广泛参与植物生长发育、逆境响应及次生代谢调控。例如，nac家族成员已被证实可响应uv-b辐射并调控花青素合成，而tify家族（特别是jaz亚家族）作为茉莉酸信号通路的负调控因子，其与uv-b信号的交互作用在多种植物中被发现与黄酮积累相关。然而，这些研究主要集中在拟南芥、烟草等模式植物，在桑树中，是否存在uv-b直接诱导的nac和tify转录因子、它们是否以及如何调控黄酮合成，完全属于未知领域。由于桑树是木本植物，其遗传转化周期长、难度大，通过常规的同源克隆或功能验证策略在桑树中筛选核心调控因子的效率极低，本领域技术人员难以从海量的转录因子中合理预期并锁定在桑树中同时响应uv-b并能显著提升黄酮含量的特定nac和tify成员。

4、因此，筛选并验证桑树中受uv-b特异性诱导的nac、tify转录因子，尤其是证明其过表达能够同时激活黄酮代谢通路多个结构基因并促进芹菜素、木犀草素及山奈酚-3-o-葡萄糖苷等多种具有高生物活性的黄酮单体积累，对突破现有技术瓶颈、实现桑树黄酮定向增产及培育功能性桑叶专用品种具有重要意义。需要指出的是，两个转录因子能够共同促进上述三种黄酮单体的积累，这一调控模式在木本植物中尚无任何报道。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是：解决现有技术中缺乏桑树黄酮合成关键调控基因、无法定向提高桑树黄酮含量的技术问题，为高黄酮桑树品种培育及功能性桑叶产品开发提供基因资源与技术支撑，提供uv-b诱导的桑树nac转录因子（nac-005324）、tify转录因子（tify-006363），以及二者在调控桑树黄酮合成中的应用方法。

2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify，所述的nac转录因子为nac-005324，受低剂量uv-b诱导上调表达，编码序列见序列表seqidno:1，氨基酸序列如seqidno:3所示，过表达该转录因子可上调桑树黄酮代谢通路关键基因表达，促进黄酮类物质合成；

3、所述的tify转录因子为tify-006363，受低剂量uv-b诱导上调表达，编码序列见序列表seqidno:2，氨基酸序列如seqidno:4所示，过表达该转录因子可上调桑树黄酮代谢通路关键基因表达，促进黄酮类物质合成。

4、进一步，所述的nac转录因子的重组表达载体以二元载体pzygc为骨架，由camv35s启动子驱动，插入nac-005324的编码序列。

5、进一步，所述的tify转录因子的重组表达载体以二元载体pzygc为骨架，由camv35s启动子驱动，插入tify-006363的编码序列。

6、uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify在调控黄酮中的应用，包括以下步骤：

7、步骤1.从药桑cdna中扩增seqidno:1的nac-005324或seqidno:2的tify-006363的编码序列；

8、步骤2.将编码序列克隆至pzygc载体，获得重组表达载体；

9、步骤3.将重组表达载体转入发根农杆菌k599，制备转化液；

10、步骤4.用转化液浸泡桑叶，真空渗透处理；

11、步骤5.黑暗培养3d后，光周期培养4d，获得黄酮含量提升的桑叶。

12、进一步，所述的真空渗透处理条件为0.08mpa，处理时间10min。

13、进一步，所述的黑暗培养温度为24℃，所述的光周期培养条件为24℃、16h光照/8h黑暗。

14、本发明的uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify及其在调控黄酮中的应用，其有益效果是：

15、1.提供关键基因资源：填补了uv-b调控桑树黄酮合成的转录因子空白，为桑树基因工程改良提供了核心基因靶点；尤其是本发明首次在木本植物桑树中证实nac和tify转录因子响应uv-b并正向调控黄酮合成，这一发现具有预料不到的技术效果；

16、2.显著提升黄酮含量：瞬时过表达nac-005324可显著上调槲皮素-o-鼠李糖基-o-鼠李糖基-o-己糖苷-ii、芹菜素、木犀草素、山奈酚-3-o-葡萄糖苷4种黄酮；过表达tify-006363可显著上调芹菜素、芹菜素-7-o-葡萄糖苷、木犀草素、山奈酚-3-o-葡萄糖苷4种黄酮，黄酮含量提升效果显著；其中，nac-005324过表达使上述黄酮含量提升至对照组的2.34～2.91倍，tify-006363过表达使上述黄酮含量提升至对照组的2.38～3.41倍；

17、3.应用便捷高效：采用农杆菌介导的瞬时转化技术，操作简单、周期短（全程7d），无需稳定遗传转化，可快速验证基因功能并应用于桑叶黄酮定向增产；

18、4.适用范围广：可用于药桑、果桑、叶用桑等不同桑树品种的黄酮合成调控，为功能性桑叶茶、桑叶提取物等产品开发提供技术支撑，经济与社会效益显著。

1.uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify，其特征是：所述的nac转录因子为nac-005324，编码基因核苷酸序列如seqidno:1所示，氨基酸序列如seqidno:3所示，受低剂量uv-b诱导上调表达，过表达该转录因子可上调桑树黄酮代谢通路关键基因表达，促进黄酮类物质合成；

2.根据权利要求1所述的uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify，其特征是：所述的nac转录因子的重组表达载体以二元载体pzygc为骨架，由camv35s启动子驱动，插入seqidno:1所示的nac-005324的编码序列。

3.根据权利要求1所述的uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify，其特征是：所述的tify转录因子的重组表达载体以二元载体pzygc为骨架，由camv35s启动子驱动，插入seqidno:2所示的tify-006363的编码序列。

4.根据权利要求2或3所述的uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify，其特征是：所述的重组表达载体含卡那霉素抗性基因。

5.权利要求1～4任一所述的uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify在调控黄酮中的应用，其特征是：包括以下步骤：

6.根据权利要求5所述的uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify在调控黄酮中的应用，其特征是：所述的真空渗透处理条件为0.08mpa，处理时间10min。

7.根据权利要求5所述的uv-b诱导型桑树转录因子nac和tify在调控黄酮中的应用，其特征是：所述的黑暗培养温度为24℃，所述的光周期培养条件为24℃、16h光照/8h黑暗。