一种基于中空纤维膜的血管化类器官芯片及类器官培养方法和应用与流程

本发明属于生物医学工程，特别涉及一种基于中空纤维膜的血管化类器官芯片及类器官培养方法和应用。

背景技术：

1、类器官是在体外三维培养环境中，由成体干细胞或多能干细胞自主分化、自组织形成的微型三维器官，能够在一定程度上再现人体器官的细胞组成、空间结构和部分生理功能。类器官已被用于发育研究、疾病建模、药物评价和个性化治疗。然而，现有类器官多数依赖静态水凝胶或培养液浸泡方式获得氧气和营养物质，随着类器官体积增大，其内部容易出现氧气、葡萄糖和生长因子供应不足以及代谢废物积累，从而产生类器官中心坏死、细胞分化不均一和功能衰减的问题。

2、体内组织通常依靠毛细血管网络维持物质交换。血管内皮细胞不仅构成选择性屏障，还在流体剪切力作用下形成细胞极性、细胞间连接和血管活性表型，并通过旁分泌信号参与组织成熟与炎症调控。传统类器官培养体系缺少能够持续灌流并承受剪切力的内皮界面；仅将内皮细胞与类器官混合培养，常形成随机、封闭且不能与外部灌流回路连通的血管样结构，难以模拟真实的血液-内皮-基底膜-组织传质路径。

3、现有器官芯片通常利用平面微流道或水凝胶微通道构建血管界面。平面微流道易于观察，但比表面积有限，难以在有限体积内形成三维仿血管网络。水凝胶微通道虽然具有较好的生物相容性，但其长期机械稳定性、抗渗漏能力、批量制造和模块化封装能力仍需提高。现有技术还有通过可透过液体和气体的光聚合材料形成三维互连微管网络，在微管之间填充水凝胶并培养细胞聚集体。该技术有助于调控类器官内部的空间信号，但依赖高分辨率光聚合制造技术，设备成本和制造复杂度较高。

4、另外，现有的中空纤维膜细胞培养装置多将中空纤维膜用于单一营养物质交换，无法使得中空纤维膜内壁或者外壁的内皮细胞均能获得适宜的剪切力，无法有效形成可灌流血管网络，对类器官的培养不利。

5、因此，有必要提供一种可工程化放大的血管化类器官芯片，让位于内壁或者外壁的内皮细胞均能获得适宜的剪切力，这有助于培养类器官。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种基于中空纤维膜的血管化类器官芯片及类器官培养方法和应用。本发明所述基于中空纤维膜的血管化类器官芯片使中空纤维膜在类器官培养过程中实现氧气、二氧化碳和溶解性营养物质的跨膜传递，让位于中空纤维膜内壁或者外壁的内皮细胞均能获得适宜的剪切力，并通过可控的基底膜仿生界面和类器官固定结构促进内皮出芽及可灌流血管网络形成，十分有利于类器官的培养。

2、中空纤维膜具有高比表面积、可控孔结构、良好传质能力以及易于集束、编织和灌封的特点，可同时作为流体通道、选择性传质界面和细胞支撑载体。但现有技术中的中空纤维膜细胞培养装置多将其用于单一营养物质交换，无法将中空纤维膜的气体传递、溶质传递、内皮剪切调控、基底膜界面构建和类器官血管化整合于同一芯片中。特别是，当内皮细胞位于中空纤维膜外壁时，仅依靠中空纤维膜管腔内流动不能使外壁内皮获得沿细胞表面的切向剪切力。而如果将类器官直接黏附于内皮层，又容易造成局部内皮脱落、传质面积下降和内皮极性紊乱，但本发明所述血管化类器官芯片能解决这些技术问题。

3、本发明所述血管化类器官芯片是一种基于可气液双传递的中空纤维膜血管化类器官芯片，解决现有类器官培养体系中供氧和营养物质传递受限、内皮细胞缺乏生理性流体剪切力、内皮屏障与类器官空间关系难以控制、内皮血管样结构不能稳定接入外部灌流回路以及装置难以标准化放大等问题。

4、本发明的第一方面提供一种基于中空纤维膜的血管化类器官芯片。

5、具体的，一种基于中空纤维膜的血管化类器官芯片，包括芯片壳体，以及置于所述芯片壳体内的培养腔，所述培养腔内包括中空纤维膜、第一流路、第二流路、内皮细胞层、基底膜仿生界面层；

6、所述中空纤维膜将中空纤维膜的管腔与中空纤维膜外培养空间分隔；

7、所述第一流路包括管腔侧入口、中空纤维膜的管腔以及管腔侧出口；

8、所述第二流路包括培养腔入口、培养腔以及培养腔出口；

9、所述内皮细胞层设置于中空纤维膜的内壁和/或外壁；

10、所述基底膜仿生界面设置于所述中空纤维膜与培养腔之间。

11、所述第一流路是所述中空纤维膜所形成的管腔，以管腔入口和管腔出口形成的灌流回路。

12、所述第一流路与所述第二流路是两条不同，且相互隔离的回路。

13、优选地，所述中空纤维膜可以传递气体或溶质。在培养类器官的过程中，类器官在中空纤维膜的膜外，氧气或二氧化碳能够通过中空纤维膜的膜孔跨越膜壁扩散到膜外；葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐、生长因子等溶解性物质可以通过膜孔传递到膜外，为类器官的生长提供所需营养物质。

14、优选地，所述中空纤维膜包括均质多孔膜、非对称多孔膜或复合膜中的任一种。

15、优选地，当所述中空纤维膜需要传递气体时，所述中空纤维膜的材料组成包括聚-4-甲基-1-戊烯（pmp）、聚二甲基硅氧烷（pdms）、聚丙烯（pp）、聚乙烯（pe）、聚四氟乙烯（ptfe）或其复合而成的材料中的至少一种。

16、优选地，当所述中空纤维膜需要传递液体时，所述中空纤维膜的材料组成包括聚醚砜（pes）、聚偏乙烯（pvdf）、聚砜（psf）、聚丙烯腈（pan）、醋酸纤维素（ca）、三醋酸纤维素（cta）、聚氨酯（pu）、聚酰亚胺（pi）、聚醚酰亚胺（pei）或其复合而成的材料中的至少一种。

17、优选地，所述中空纤维膜的膜壁厚度为25-400 μm，进一步优选为100-300 μm。

18、优选地，所述中空纤维膜的外径为150-1800 μm，内径为50-1000 μm，膜壁厚度可为25-400 μm。

19、所述第一流路包括管腔侧入口、中空纤维膜的管腔以及管腔侧出口；

20、优选地，所述管腔侧入口和管腔侧出口均与所述中空纤维膜的管腔之间设置独立进出口组件，并在所述独立进出口组件表面设置了灌封密封件，而且中空纤维膜的两端分别通过灌封密封件与芯片壳体密封连接。灌封密封件起到固定和密封作用，防止所述中空纤维膜的管腔在培养类器官过程中发生偏移，也隔离所述第一流路与所述第二流路，且液体可通过管腔侧入口穿过灌封密封件中的独立进出口组件进入到所述中空纤维膜的管腔中，且液体能继续通过所述中空纤维膜的管腔，穿过灌封密封件中的独立进出口组件从管腔侧出口流出。

21、优选地，所述内皮细胞层设置于所述中空纤维膜的内壁或外壁。当内皮细胞层中的内皮细胞位于所述中空纤维膜的内壁时，管腔侧（即所述中空纤维膜的管腔）培养液沿中空纤维膜所形成的管腔轴向流动并直接作用于内皮细胞顶端表面，使其接受切向剪切力；当内皮细胞层中的内皮细胞位于所述中空纤维膜的外壁时，管腔侧用于供给氧气和营养物质，所述中空纤维膜的第二流路使培养液沿中空纤维膜外壁轴向或周向低剪切流动，使内皮细胞直接接受膜外剪切力。

22、优选地，所述第一流路与所述第二流路彼此独立。

23、优选地，所述第一流路还包括第一储液器、第一驱动泵、第一管路、第一取样口和第一流量调节装置。

24、优选地，所述第二流路还包括第二储液器、第二驱动泵、第二管路、第二取样口和第二流量调节装置。

25、优选地，所述第一驱动泵和第二驱动泵各自独立地选自蠕动泵、注射泵、压力驱动泵、隔膜泵或者其他能够提供稳定微流量的微流控驱动设备。

26、优选地，所述第一驱动泵和第二驱动泵各自独立地与微流控芯片、流体控制器及自动化灌流装置配套使用。

27、优选地，通过独立调节所述第一流路与所述第二流路的流量与压力，可在保持较低跨膜压差的同时，分别控制所述中空纤维膜的内壁内皮细胞或外壁内皮细胞所受剪切力，并根据培养需求实现连续灌流、间歇灌流、脉冲灌流或流量梯度调控，从而减少过量跨膜对流造成的细胞脱落或基质流失。

28、优选地，所述内皮细胞层中的内皮细胞选自人脐静脉内皮细胞、微血管内皮细胞、器官特异性内皮细胞、内皮祖细胞、诱导多能干细胞来源内皮细胞及这些细胞的组合。

29、进一步优选地，所述内皮细胞层中加入周细胞、血管平滑肌细胞、间充质基质细胞、成纤维细胞或免疫细胞。以稳定内皮网络或构建组织特异性微环境。

30、优选地，当所述血管化类器官芯片培养类器官时，所述类器官在所述中空纤维膜外，且在所述培养腔中，所述基底膜仿生界面设置于内皮细胞层与类器官之间。

31、优选地，所述基底膜仿生界面包含胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、明胶、透明质酸、matrigel（基质胶）、gelma（甲基丙烯酰化明胶）、脱细胞细胞外基质及其组合。

32、优选地，所述基底膜仿生界面为膜表面包被层、薄层水凝胶或具有微孔的类器官固定支架。

33、优选地，所述基底膜仿生界面层具有允许内皮细胞迁移和基质重塑的结构。通过调节胶原蛋白浓度、凝胶交联密度、基质降解性以及vegf、fgf、ang-1、s1p或器官特异性血管生成因子的空间分布，诱导中空纤维膜外壁内皮细胞向类器官方向形成出芽，并使出芽结构进入类器官内部。出芽结构可与类器官内源性内皮细胞或微血管样结构连接。

34、优选地，所述中空纤维膜为单根、平行阵列、编织膜布或交叉阵列。不同中空纤维或膜丝组可连接独立的管腔侧入口和管腔侧出口，用于分别输送基础培养液、含氧培养液、气体、混合气体、药物、细胞因子。

35、所述血管化类器官芯片可根据不同细胞、组织及类器官的培养需求，对中空纤维膜的材料、孔径、壁厚、气体及液体通透性能、灌流参数及基底膜仿生界面层成分进行调整，适用于肝、肾、肺、心脏、肠道、脑、胰腺、肿瘤等多种组织或类器官的培养与血管化构建，并可拓展应用于器官芯片构建、疾病模型建立、药物筛选与毒性评价、组织发育及血管生成机制研究、细胞治疗产品培养、再生医学以及个性化精准医疗等场景。所述芯片既可以作为独立培养单元使用，也可与其他组织培养模块、传感监测模块、培养基处理模块组合，以形成单器官或多器官联用的体外仿生培养与评价平台。

36、优选地，当利用所述血管化类器官芯片培养类器官时，所述类器官于中空纤维膜外侧培养，且培养的过程中，所述培养腔中还包括类器官固定结构。所述类器官通过水凝胶包埋、微孔捕获等方式被固定在内皮细胞层附近。

37、优选地，使所述类器官表面至中空纤维膜外壁的距离为20-500 μm，更优选为50-100 μm。保留部分内皮细胞表面与中空纤维膜膜外流体直接接触。

38、本发明的第二方面提供一种类器官培养方法。

39、具体的，一种类器官培养方法，包括以下步骤：

40、将类器官置于所述血管化类器官芯片的培养腔中，且所述类器官在所述中空纤维膜膜外。

41、优选地，所述类器官培养方法，包括以下步骤：

42、（1）制备所述第一流路，并进行灭菌；

43、（2）利用多巴胺盐酸盐溶液、蛋白对所述中空纤维膜所形成的管腔进行改性处理，然后接种内皮细胞，进行培养，形成所述内皮细胞层；

44、（3）在所述中空纤维膜膜外设置基底膜仿生界面，并固定类器官；

45、（4）设置所述第二流路，然后在所述第一流路中通入培养基，且在所述第二流路中通入类器官培养液，进行类器官的培养。

46、本发明的第三方面提供上述基于中空纤维膜的血管化类器官芯片的应用。

47、上述基于中空纤维膜的血管化类器官芯片在组织发育、疾病建模、药物筛选与毒性评价、血管生成机制研究或细胞产品培养领域中的应用。

48、相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

49、（1）本发明利用中空纤维膜形成的血管化类器官芯片可实现氧气、二氧化碳以及水和溶解性营养物质的传递，缩短类器官内部细胞与传质界面的距离，有利于维持长期培养过程中的氧和营养稳态。

50、（2）内皮细胞可以根据类器官需要选择性设置于中空纤维膜内壁或外壁；内壁内皮接受管腔侧剪切力，外壁内皮接受独立膜外低剪切灌流，从而克服仅有管腔流动时外壁细胞无法获得切向剪切力的问题。

51、（3）基底膜仿生界面层将中空纤维膜、内皮细胞层和类器官形成可控的空间耦合，避免类器官直接压迫内皮细胞层，并为内皮细胞迁移、出芽和血管网络侵入提供结构通道。

52、（4）中空纤维膜具有较高机械强度，可采用成熟的膜丝集束、编织和灌封工艺构建可更换培养卡匣，易于实现多膜丝并联、规模放大和批次标准化。

53、（5）管腔侧和膜外侧采用独立灌流回路，可分别控制剪切力、压力、气体组成和刺激物浓度，适用于器官发育、肿瘤微环境、药物跨内皮转运和毒性评价等研究。

54、（6）通过将外壁上的内皮细胞层与类器官内血管样结构连接，可使灌流通道、内皮屏障和类器官组织形成连续功能单元，为构建可灌流的血管化类器官提供工程基础。