一种β-葡萄糖苷酶Cel1A的突变体及其在水解纤维二糖中的应用

本发明属于酶工程与生物催化，具体涉及一种β-葡萄糖苷酶cel1a的突变体及其在水解纤维二糖中的应用。

背景技术：

1、纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，全球每年由光合作用产生的纤维素达1000亿吨。将纤维素转化为可发酵糖，用于生产生物燃料、生物基精细化学品和药品，是一种环境友好、可持续的过程。纤维素酶系主要由外切葡聚糖酶（ec 3.2.1.91）、内切葡聚糖酶（ec 3.2.1.4）和β-葡萄糖苷酶（ec 3.2.1.21）三种组分酶协同作用组成。其中，β-葡萄糖苷酶负责将纤维二糖和短纤维低聚物水解为葡萄糖，是纤维素降解过程的限速酶。

2、β-葡萄糖苷酶在纤维素酶系中的占比极低且活性不高，这严重影响了整体纤维素酶的协同作用，从而制约了纤维素的水解效率。在酶水解过程中，β-葡萄糖苷酶活性不足会导致纤维二糖的积累，而纤维二糖的积累会强烈抑制内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性，阻碍纤维素的进一步降解。因此，提高β-葡萄糖苷酶的水解活性对于提升纤维素酶的整体水解效率具有重要意义。

3、目前野生型cel1a的水解活性仍然较低，其催化效率（kcat/km）仅为2.099 min-¹·mm-¹，无法满足工业化应用的需求。因此，亟需通过酶工程改造手段提高cel1a的水解活性，为纤维素的高效降解和生物燃料的规模化生产提供技术支持。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了克服野生型里氏木霉β-葡萄糖苷酶cel1a在纤维二糖水解过程中存在的催化活性低、催化效率差、无法满足工业化纤维素降解需求的技术缺陷。

2、本发明提供种β-葡萄糖苷酶cel1a突变体，所述突变体是以seq id no.1为出发序列，突变将第127位、第157位、第167位、第240位、第329位、第394位中的任意一位或多位突变获得的。

3、进一步地限定，突变体如下任意一个所示：

4、（（1）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第394位的n突变为d，第240位的k突变为v；

5、（2）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第167位的l突变为w，第240位的k突变为v；

6、（3）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第394位的n突变为d，第240位的k突变为h；

7、（4）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第167位的l突变为w，第240位的k突变为h；

8、（5）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第394位的n突变为d，第240位的k突变为r；

9、（6）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第167位的l突变为w，第240位的k突变为r；

10、（7）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第394位的n突变为d；

11、（8）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第127位的h突变为d；

12、（9）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第167位的l突变为w；

13、（10）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第329位的n突变为d；

14、（11）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第157位的v突变为c；

15、（12）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第240位的k突变为v；

16、（13）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第240位的k突变为w；

17、（14）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第240位的k突变为q；

18、（15）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第240位的k突变为r；

19、（16）所述突变体是以seq id no.1为出发序列，第240位的k突变为h。

20、本发明提供一种编码上述的突变体的基因。

21、本发明提供一种含有上述基因的重组载体。

22、本发明提供一种含有上述基因的重组微生物细胞。

23、进一步地限定，出发微生物细胞为真核微生物细胞或原核微生物细胞。

24、本发明提供一种上述的突变体、上述的基因、上述的重组载体或上述的重组微生物细胞在提高β-葡萄糖苷酶活性中的应用。

25、本发明提供一种上述的突变体、上述的基因、上述的重组载体或上述的重组微生物细胞制备葡萄糖中的应用。

26、本发明提供一种上述的突变体、上述的基因、上述的重组载体或上述的重组微生物细胞在水解纤维二糖中的应用。

27、本发明提供一种水解纤维二糖的方法，将上述的突变体加入到含有纤维二糖的水溶液中反应，反应ph为4.8，最适反应温度为37℃，反应至少10分钟时间。

28、有益效果：1. 水解活性显著提升：通过机器学习法与氨基酸位点保守性分析相结合的半理性设计策略，成功筛选获得关键突变位点k240v和n394d。最优双突变体cel1a-n394d-k240v的相对酶活达到野生型cel1a的3.52倍，水解活性提升效果显著。

29、2. 催化效率大幅提高：酶动力学参数测定结果显示，双突变体cel1a-n394d-k240v的米氏常数km为57.77 mm，较野生型（130.6 mm）降低了55.76%，表明底物亲和力显著增强；催化常数kcat为431.449 min-¹，较野生型（274.189 min-¹）提高了57.35%；催化效率kcat/km为7.468 min-¹·mm-¹，较野生型（2.099 min-¹·mm-¹）提高了255.79%。

30、3. 底物通道优化：通过caverdock通道能量分析发现，双突变体cel1a-n394d-k240v中纤维二糖进入活性中心的能量壁垒降低，产物葡萄糖释放的能量壁垒也降低，表明突变改善了底物进入和产物释放的动力学特性，从分子层面揭示了水解活性提高的机理。

31、4. 酶学性质稳定：最适反应ph和最适反应温度测定结果显示，双突变体cel1a-n394d-k240v的最适反应ph为4.8，最适反应温度为37℃，与野生型cel1a保持一致，表明突变在提高水解活性的同时未改变酶的基本反应条件，有利于直接应用于现有的纤维素酶解工艺体系。

32、5. 工业化应用前景广阔：本发明提供的突变型β-葡萄糖苷酶可有效缓解纤维二糖积累对内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的反馈抑制作用，显著提升纤维素酶系的整体水解效率，为纤维素的工业化降解和生物燃料的规模化生产提供了切实可行的技术方案。

1.一种β-葡萄糖苷酶cel1a突变体，其特征在于，所述突变体是以seq id no.1为出发序列，突变将第127位、第157位、第167位、第240位、第329位、第394位中的任意一位或多位突变获得的。

2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，突变体如下任意一个所示：

3.编码权利要求1或2所述的突变体的基因。

4.含有权要求3所述基因的重组载体。

5.含有权利要求3所述基因的重组微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的重组微生物细胞，其特征在于，出发微生物细胞为真核微生物细胞或原核微生物细胞。

7.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的重组载体或权利要求5或6所述的重组微生物细胞在提高β-葡萄糖苷酶活性中的应用。

8.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的重组载体或权利要求5或6所述的重组微生物细胞制备葡萄糖中的应用。

9.权利要求1或2所述的突变体、权利要求3所述的基因、权利要求4所述的重组载体或权利要求5或6所述的重组微生物细胞在水解纤维二糖中的应用。

10.一种水解纤维二糖的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的突变体加入到含有纤维二糖的水溶液中反应，反应ph为4.8，最适反应温度为37℃，反应至少10分钟时间。