一种白三叶毛状根遗传转化体系构建方法及其应用

本发明涉及植物转基因工程，具体涉及一种白三叶毛状根遗传转化体系构建方法及其应用。

背景技术：

1、白三叶(trifolium repens l.)作为优质豆科牧草和地被植物具有重要的应用价值，但其耐干旱、盐碱能力差等原因致使其应用受到限制，转基因技术的快速发展为白三叶种质创新提供了有效技术手段。但白三叶的再生能力差，是公认的遗传转化“困难户”，现有针对白三叶的遗传转化研究，主要采用相对高效的根癌农杆菌介导法进行愈伤组织的转化，但其转化效率仅在0.3～10%之间，并且愈伤组织转化耗时漫长，严重影响了白三叶品种的选育效率。

2、发根农杆菌是根瘤菌科（rhizobiaceae）农杆菌属（agrobacterium）的一种革兰氏阴性土壤细菌，它可使植物宿主细胞组织产生毛状根瘤，其携带的ri（root inducing）质粒在感染植物后可使外植体在短时间内诱导出大量毛状根（hairy root）。发根农杆菌诱导形成的毛状根具有多分枝、无向地性、生长快、遗传特性稳定等特征，可用于植物基因功能分析和次生代谢等方面的研究。

3、针对白三叶毛状根遗传转化的研究，最早可追溯到1990年，科学家利用野生型发根农杆菌菌株（c58c1携带pri 15834质粒），成功在白三叶上诱导出了毛状根，并通过southern 杂交分析验证了其转基因特性（k.judith webb,等. characterization oftransgenic root cultures of trifolium repens, trifolium pratenseandlotuscorniculatusand transgenic plants oflotus corniculatus.plant sci.(1990):243-254）。该研究证明了利用发根农杆菌转化白三叶在技术上是可行的，但发根农杆菌诱导的“毛状根”中，常混杂着大量未成功转化但形态相似的“假阳性”不定根，筛选工作量大，现有研究并未针对该问题给出解决方案。

4、针对白三叶毛状根遗传转化的研究，目前公开的报道较少，白三叶与紫花苜蓿属于同族物种，发明人将现有发根农杆菌介导的紫花苜蓿毛状根遗传转化体系应用于白三叶转化研究时，发现存在外植体伤口易褐化腐烂、阳性转化效率低等突出问题。

5、因此，虽然已有利用发根农杆菌诱导其毛状根的成功案例，但相关研究仍不充分，尚未建立起一个高效、稳定、可视化的白三叶毛状根遗传转化体系。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供一种高效、稳定、可视化的白三叶毛状根遗传转化体系构建方法及其应用，为白三叶功能基因的研究及品种改良提供技术支持。

2、为了实现上述目的，本发明提供了以下技术方案。

3、首先，本发明提供了一种白三叶毛状根遗传转化体系构建方法，它包括以下步骤：

4、步骤1、将含有ruby报告基因的植物双元表达载体转入发根农杆菌的感受态细胞中，经抗性筛选、分子鉴定获得阳性克隆；所述发根农杆菌选自ar.qual菌株、k599菌株和msu440菌株中的至少一种；

5、步骤2、扩繁培养所述阳性克隆，收集菌体后重悬并调节菌液的od600值至0.5～0.9，静置活化得到浸染用菌悬液；

6、步骤3、选取子叶长出但未张开的白三叶幼苗，切除根部和部分子叶，剩下的子叶和下胚轴为转化用外植体；

7、步骤4、将步骤3获得的外植体置于步骤2的菌悬液中侵染50min；

8、步骤5、将侵染后的外植体置于共培养基中在黑暗中22℃恒温共培养2天后转入生根培养基中进行毛状根的诱导培养；

9、步骤6、根据红色表型特征和分子鉴定获得白三叶转基因毛状根。

10、进一步的，所述含有ruby报告基因的植物双元表达载体选自3302-35s-ruby载体、3302- trcml6-ruby载体中的至少一种。3302-35s-ruby载体是在pcambia3302骨架上构建的，其t-dna区仅包含由camv 35s启动子驱动的ruby报告基因表达盒；3302- trcml6-ruby载体是在3302-35s-ruby载体骨架上构建的，其t-dna区包含由camv 35s启动子驱动的trcml6基因表达盒。

11、进一步的，所述步骤1中分子鉴定使用的pcr引物包括针对ruby基因的特异性引物3302-ruby-f/r和针对trcml6基因的特异性引物trcml6-f/r；所述特异性引物3302-ruby-f的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述特异性引物3302-ruby-r的核苷酸序列如seq idno.2所示，所述特异性引物trcml6-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述特异性引物trcml6-r的核苷酸序列如seq id no.4所示。

12、进一步的，所述步骤2中使用含有50mg/l硫酸卡那霉素和50mg/l链霉素的ty液体培养基进行阳性克隆的扩繁培养。

13、进一步的，所述步骤2中使用fm液体培养基重悬菌体并调节菌液浓度，所述fm液体培养基的ph值为7.5，含有以下浓度的组分：246.4mg/l的mgso4·7h2o、190.6 mg/l kh2po4、227.2 mg/l na2hpo4、303 mg/l kno3、588 mg/l cacl2·2h2o、1mg/l mnso4、 1mg/l cuso4、1mg/l znso4、1mg/l h3bo3、1mg/l na2moo4、24.4 mg/l柠檬酸铁。

14、进一步的，所述fm液体培养基中加入乙酰丁香酮和固化剂得到fm+as培养基，所述fm+as培养基为步骤5中使用的共培养基。所述fm+as培养基中乙酰丁香酮的浓度为100μmol/l，固化剂优选植物琼脂，浓度为8g/l。

15、进一步的，所述fm液体培养基中加入固化剂得到fm培养基，所述fm培养基为步骤5中使用的生根培养基。所述fm培养基中固化剂优选植物琼脂，浓度为8g/l。

16、进一步的，所述步骤5中毛状根诱导培养的培养条件为：温度为22℃，光照周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为12000 lx。

17、进一步的，所述步骤3中白三叶幼苗是以海发白三叶的种子培养得到。

18、其次，本发明请求保护上述白三叶毛状根遗传转化体系构建方法在白三叶品种选育中的应用。

19、与现有技术相比，本发明具备以下有益效果：

20、（1）本发明通过构建白三叶毛状根遗传转化体系，提供了一种简便的白三叶转基因操作流程，其绕过白三叶再生能力差的问题，可缩短白三叶遗传转化周期，提高转化效率，该毛状根遗传转化体系可用于白三叶基因功能的分析，提高了白三叶抗逆品种的选育效率。

21、（2）本发明通过引入ruby报告基因，使成功转化的毛状根呈现特征性的宝石红色；这一特性使得研究人员能够在诱导早期，无需任何染色或分子检测，即可通过肉眼直观、快速、无损地筛选出阳性毛状根，极大地提高了筛选效率和准确性。

22、（3）本发明从发根农杆菌菌株、菌悬液浓度、外植体类型、侵染和培养等各个环节进行系统性地筛选和优化，建立了高效、可靠的可视化筛选体系，其阳性毛状根诱导率可达到20%以上。

23、（4）本发明为白三叶基因功能研究（如根系发育、抗逆基因验证）、次生代谢物生产以及利用基因编辑技术进行品种改良提供了一个高效、稳定、可视化的技术平台，应用前景广阔。