一种续随子ElChlI基因VIGS沉默体系的构建方法及其产品

本发明属于生物，具体提供了一种续随子

elchli基因vigs沉默体系的构建方法及其产品。

背景技术：

1、续随子(

euphorbia lathyris l.)是大戟科大戟属的传统药用植物和能源植物，其种子富含黄酮、二萜和油脂，不仅是具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤活性的药材，还是优质的工业柴油原料。因此，挖掘续随子中合成和调控油脂、黄酮、二萜等化合物合成的关键基因，培育优质品种是育种工作者们的育种目标。但是目前续随子的转基因体系尚不完全成熟，遗传转化周期较长，缺乏一种快速，高效的鉴定体系，严重阻碍了续随子的基因功能验证，导致续随子中黄酮、二萜、油脂等化合物的合成和调控基因报道不多，基因育种受到限制。

2、目前，续随子的转基因体系主要为稳定转化法，只有一项实审发明专利(公开(公告)号：cn117965610a，一种续随子毛状根稳定遗传转化的方法)，操作步骤繁琐复杂，且受限于茎尖、新鲜叶片组织等转化受体材料，难以大规模获取，且完成周期长。因此亟待建立一种快速验证续随子基因功能的方法，为续随子基因功能研究奠定基础。

3、病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，vigs)技术是一项能快速鉴定基因功能的反向遗传学方法，具有操作简便、周期短、成本低的优势。vigs是植物体内普遍存在的一种遗传免疫机制，用于抵御外源核酸入侵，可被病毒rna激活，属于转录后沉默。如果在病毒载体中插入目标片段，侵染寄主植物后，目的基因片段的重组病毒可以抑制植物内源基因表达，植物会表现出目标基因功能丧失或表达水平下降的表型。利用这种机制，可以确定目标基因的功能。目前尚无利用vigs体系鉴定续随子中基因功能的报道。

技术实现思路

1、发明目的：提供一种续随子

elchli基因的vigs沉默体系构建方法及其产品，可实现简单、快速地沉默续随子

elchli基因。

2、技术方案：为实现上述目的，本发明采用以下构建方法：

3、提供了一种续随子镁螯合酶亚基i基因

elchli（magnesium-chelatase subuniti），其全长基因序列如seq id no. 1所示。

4、提供了一种用于沉默续随子

elchli的

elchli基因特异性片段，其核苷酸序列如seq id no. 2所示。

5、进一步地，构建一种沉默续随子

elchli的vigs病毒载体，以续随子cdna为模版扩增

elchli基因特异性片段，所用引物核苷酸序列如seq id no. 3~4所示。

6、进一步地，采用

ecori和

kpni限制性内切酶将

elchli基因特异性片段和vigs病毒骨架载体ptrv2双酶切，之后采用t4 dna连接酶连接，构建获得重组病毒载体ptrv2-

elchli。

7、进一步地，通过冻融法将重组病毒沉默载体转化到农杆菌感受态细胞，通过菌落pcr鉴定阳性菌株。

8、进一步地，将分别携带ptrv1、ptrv2和ptrv2-

elchli质粒的农杆菌菌液培养至od600在0.5~1.0之间。收集菌体后，将重悬的ptrv1分别与ptrv2和ptrv2-

elchli农杆菌菌液按体积比1:1混合制成混合菌液。

9、进一步地，将续随子幼苗倒扣置于菌液中，放入在植物活体转化仪中，设置侵染条件：6 kpa、30 s，侵染后室温避光培养24 h；之后在20℃，光照8h/黑暗16h的培养条件下培养。

10、进一步地，采用实时荧光定量法，检测侵染10天后

elchli基因的表达量水平，所用引物核苷酸序列如seq id no. 5~6所示。

11、本发明的有益效果为：

12、(1) 本发明首次构建了续随子

elchli基因vigs沉默体系，获得了能够使续随子基因沉默的体系。

13、(2) 本发明采用烟草脆裂病毒构建续随子

elchli基因沉默体系，能够在续随子植株内进行系统扩散传播。

14、(3) 本发明所述沉默体系能够有效降低续随子

elchli基因的表达水平，叶片出现黄化表型，具有操作简单、材料易得、出现表型周期短等优势，解决了传统利用组培苗、毛状根等转化体系步骤繁琐、实验周期长的问题，为大规模开展快速鉴定续随子中的基因功能供了有效工具。

1.一种续随子镁螯合酶亚基i基因（magnesium-chelatase subunit i，elchli）序列，其特征在于：其全长基因的核苷酸序列如seq id no. 1所示。

2.一种用于沉默如权利要求1所述续随子elchli基因的特异性片段，其特征在于：所述elchli基因特异性片段的核苷酸序列如seq id no. 2所示。

3.一种沉默如权利要求1所述续随子elchli基因的vigs载体，其特征在于：利用内切酶克隆技术将elchli基因特异性片段连接至vigs病毒骨架载体ptrv2中，构建获得重组病毒载体ptrv2-elchli；所述elchli基因特异性片段的扩增引物核苷酸序列如seqid no. 3~4所示。

4.一种如权利要求1所述续随子elchli基因的vigs沉默体系的构建方法，包括以下步骤：

5.一种用于实时荧光定量pcr检测续随子elchli基因沉默后的表达水平的引物序列，其特征在于：elchli的引物核苷酸序列如seq id no. 5~6所示，参考基因的引物核苷酸序列如seq id no. 7~8所示。