DON诱导仔猪子宫氧化损伤的分子标志物、筛选方法及应用

本发明涉及动物生殖毒理学及生物，尤其涉及don诱导仔猪子宫氧化损伤的分子标志物、筛选方法及应用。

背景技术：

1、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（deoxynivalenol, don）是镰刀菌产生的一种单端孢霉烯族毒素，因其毒力强、化学性质稳定、难以降解，且在谷物中污染广泛，被列为对畜牧业危害最大的霉菌毒素之一。由于猪饲料多以谷物为原料，极易受到don污染。除引起肠道损伤、呕吐、厌食和生长抑制外，don还被证实具有生殖毒性，可通过抑制卵母细胞减数分裂等方式损害猪的繁殖能力。

2、氧化应激被认为是don等真菌毒素引发机体损伤的核心机制，其本质是细胞内活性氧（ros）过度累积，打破氧化还原稳态，进而导致脂质、蛋白质和dna等生物大分子损伤。蛋白质，特别是其半胱氨酸残基上的巯基（-sh），是ros攻击的主要靶点之一。半胱氨酸的氧化还原修饰是一种快速、可逆的翻译后修饰，能够灵敏地响应氧化还原信号，通过改变蛋白质的结构、活性、定位及相互作用，广泛参与细胞应激、凋亡、代谢和信号转导等过程的调控。

3、近年来，随着质谱技术与化学蛋白质组学方法的发展，对蛋白质氧化还原修饰进行全局性定量分析已成为可能。然而，在真菌毒素毒性机制研究领域，尤其是针对don的生殖毒性，现有研究多集中于对卵巢和卵母细胞的影响，或局限于传统的转录组和蛋白质组分析。对于don是否直接引起以及如何引起仔猪子宫——这一在结构和功能上更接近人类子宫的重要生殖器官——的氧化损伤，其分子机制尚不明确。特别是，尚缺乏从氧化还原蛋白质组学层面，系统揭示don暴露下仔猪子宫内蛋白质半胱氨酸氧化修饰全局图谱的研究，也未能明确由此引发的关键信号通路改变和特异性分子靶点。 这种认知的空白限制了对don生殖毒性的深入理解，也阻碍了开发针对性缓解措施或生物标志物。

技术实现思路

1、为解决背景技术中所提出的技术问题，本发明提供don诱导仔猪子宫氧化损伤的分子标志物、筛选方法及应用。

2、本发明采用以下技术方案实现：本发明的目的之一在于提出一种筛选don诱导仔猪子宫氧化损伤相关分子标志物的方法，所述方法包括：

3、获取经don处理与未经don处理的仔猪子宫组织样本；

4、对所述子宫组织样本进行转录组测序、蛋白质组定量分析和氧化还原蛋白质组分析；

5、通过生物信息学分析，对比两组样本，筛选满足以下至少一项条件的分子作为候选标志物：

6、（a）差异表达的基因，筛选阈值为‖log2(foldchange)‖>1且fdr<0.05；

7、（b）差异表达的蛋白质，筛选阈值为foldchange>1.5或<0.667且p值<0.05；

8、（c）差异氧化的半胱氨酸修饰位点，所述位点所在蛋白质的表达量经校正后，其修饰水平变化满足foldchange>1.5或<0.667且p值<0.05。

9、进一步的，所述氧化还原蛋白质组分析采用基于碘乙酰胺封闭、tcep还原、iodo-tmt标记、抗体富集，并结合液相色谱-串联质谱进行定量的方法。

10、进一步的，所述候选标志物包括发生氧化修饰且修饰水平上调的抗氧化蛋白，所述抗氧化蛋白选自谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物氧还蛋白、硫氧还蛋白结构域蛋白或谷氧还蛋白家族中的至少一种。

11、进一步的，所述经don处理的仔猪子宫组织样本来自通过以下方式构建的动物模型：选取健康母仔猪，连续饲喂don超标饲料28天，以使子宫组织呈现氧化损伤状态。

12、本发明的目的之二在于提出akt1蛋白的氧化修饰位点在筛选用于缓解don诱导仔猪子宫氧化损伤的药物中的用途，所述氧化修饰位点为akt1蛋白第60位和/或第77位的半胱氨酸残基；所述氧化修饰导致akt1激酶活性降低。

13、进一步的，筛选所述药物的方法包括：评估候选物质对akt1蛋白第60位和/或第77位半胱氨酸残基氧化修饰水平的抑制效果。

14、本发明的目的之三在于提出茶多酚在制备用于缓解或治疗don诱导仔猪子宫氧化损伤的药物或饲料添加剂中的用途。

15、进一步的，所述茶多酚中的主要活性成分为表没食子儿茶素没食子酸酯；所述缓解或治疗包括降低细胞活性氧水平、恢复线粒体膜电位、减少细胞凋亡及改善细胞周期阻滞中的至少一种。

16、本发明的目的之四在于提出一种用于检测或辅助诊断don诱导仔猪子宫氧化损伤的产品，其特征在于，所述产品包含用于检测权利要求1至4中任一项所述方法筛选出的分子标志物的试剂。

17、进一步的，所述分子标志物为发生氧化修饰的抗氧化蛋白，选自谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4或过氧化物氧还蛋白1中的至少一种。

18、相比现有技术，本发明的有益效果在于：

19、本发明通过整合转录组学、蛋白质组学和氧化还原蛋白质组学分析，首次在全局范围内绘制了don暴露下仔猪子宫的分子应答图谱，不仅从基因表达和蛋白丰度层面，更从蛋白质翻译后修饰（氧化还原修饰）层面，全方位揭示了don导致的氧化应激、细胞周期抑制、线粒体功能紊乱及dna损伤修复通路异常等关键生物学过程变化，为深入理解don的生殖毒性提供了全新且系统的分子见解。

20、本发明首次鉴定出akt1蛋白的第60位和/或第77位半胱氨酸残基为don诱导的超氧化修饰位点。该发现揭示了氧化应激损害akt1信号通路的一种新机制，使得上述特定位点成为筛选或设计缓解don所致子宫氧化损伤药物的全新特异性靶点，具有重要的转化应用价值。

21、本发明通过细胞模型证实，茶多酚（特别是其主要活性成分egcg）能有效逆转don引起的氧化损伤、细胞凋亡和周期阻滞。这为利用茶多酚开发防治don生殖毒性的功能性饲料添加剂或药物提供了直接且坚实的实验依据。

22、本发明所详述的基于多组学联用的筛选方法，能够系统、高效地筛选出与don子宫氧化损伤密切相关的分子标志物（如发生特定氧化的抗氧化蛋白gsr、txnrd1等）。这些标志物可用于开发早期诊断或风险预警的检测产品，对于监测饲料安全、评估猪群生殖健康状态具有实用意义。

1.一种筛选don诱导仔猪子宫氧化损伤相关分子标志物的方法，其特征在于，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化还原蛋白质组分析采用基于碘乙酰胺封闭、tcep还原、iodo-tmt标记、抗体富集，并结合液相色谱-串联质谱进行定量的方法。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述候选标志物包括发生氧化修饰且修饰水平上调的抗氧化蛋白，所述抗氧化蛋白选自谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化物氧还蛋白、硫氧还蛋白结构域蛋白或谷氧还蛋白家族中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述经don处理的仔猪子宫组织样本来自通过以下方式构建的动物模型：选取健康母仔猪，连续饲喂don超标饲料28天，以使子宫组织呈现氧化损伤状态。

5.akt1蛋白的氧化修饰位点在筛选用于缓解don诱导仔猪子宫氧化损伤的药物中的用途，其特征在于，所述氧化修饰位点为akt1蛋白第60位和/或第77位的半胱氨酸残基；所述氧化修饰导致akt1激酶活性降低。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，筛选所述药物的方法包括：评估候选物质对akt1蛋白第60位和/或第77位半胱氨酸残基氧化修饰水平的抑制效果。

7.茶多酚在制备用于缓解或治疗don诱导仔猪子宫氧化损伤的药物或饲料添加剂中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述茶多酚中的主要活性成分为表没食子儿茶素没食子酸酯；所述缓解或治疗包括降低细胞活性氧水平、恢复线粒体膜电位、减少细胞凋亡及改善细胞周期阻滞中的至少一种。

9.一种用于检测或辅助诊断don诱导仔猪子宫氧化损伤的产品，其特征在于，所述产品包含用于检测权利要求1至4中任一项所述方法筛选出的分子标志物的试剂。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于，所述分子标志物为发生氧化修饰的抗氧化蛋白，选自谷胱甘肽还原酶、硫氧还蛋白还原酶1、谷胱甘肽过氧化物酶4或过氧化物氧还蛋白1中的至少一种。