马齿苋中木犀草素的高效提取纯化方法及其在改善代谢相关脂肪性肝炎中的应用

本发明属于天然药物化学和生物医药，具体涉及一种从马齿苋中高效提取纯化木犀草素的方法，以及提取得到的木犀草素在制备用于改善代谢相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis, mash）的药物或功能性食品中的应用。

背景技术：

1、代谢相关脂肪性肝炎（metabolic dysfunction-associated steatohepatitis,mash）是代谢功能障碍相关性肝病（metabolic dysfunction-associated steatoticliver disease, masld）的关键进展阶段，如不及时治疗严重者可进一步进展为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌。mash较masld的晚期肝纤维化的发生风险增加约10倍，进展时间缩短约1/2。随着肥胖、2型糖尿病、血脂异常等代谢危险因素的全球流行，masld的发病率逐年攀升，目前全球患病率已超30%，患病总人数已超12亿，其中约四分之一的人口已发展为mash。我国masld的总体患病率也已高达29.6%，患病总人数接近2亿，并且发病率还在不断增加，现已取代病毒性肝炎成为我国第一大慢性肝病。目前全球仅一款针对mash的药物——thrβ激动剂resmetirom（rezdiffra;madrigal pharmaceuticals）于近期被美国fda批准，但尚处于临床试验阶段，还未完全推广，临床治疗仍以生活方式干预为主，有效的治疗手段仍然缺乏。此外，mash这一关键干预窗口期往往持续数年甚至数十年，长期药物治疗可能会加重肝脏代谢负担，甚至进一步引起药物性肝炎。因此，基于药物的局限性及mash的庞大患病人群和其进展性危害，寻找安全、有效的天然产物用于改善mash成为研究热点。

2、马齿苋（portulaca oleracea l.），又称为长寿菜、马唐菜等，属于马齿苋科马齿苋属，是一种分布广泛的药食两用植物，其味酸、性寒，传统中医认为其归肝经，对肝脏具有保护作用。现代研究表明，其含有黄酮、多糖、生物碱等多种生物活性成分，具备多种药用和营养价值，被广泛用于中医药和食品加工中。木犀草素（luteolin, lo）是一种天然黄酮类化合物，结构式如下式i所示，广泛存在于多种植物中，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多种药理活性。然而，马齿苋中木犀草素的含量通常较低，且与其他黄酮类化合物、杂质等共存，难以直接分离获得高纯度产品。现有木犀草素的提取纯化方法多存在操作复杂、纯化效率低、产品纯度不高、成本较高等问题，难以满足规模化生产及医药应用的需求。同时，目前关于马齿苋来源的木犀草素在改善mash中的具体作用尚未有明确的专利报道，限制了其在医药领域的应用。

3、

4、式i

5、因此，开发一种操作简便、高效稳定、可规模化制备高纯度马齿苋木犀草素的方法，并明确其在改善mash中的应用，具有重要的理论意义和实际应用价值。

技术实现思路

1、本发明旨在解决现有技术中从马齿苋中提取纯化木犀草素效率低、纯度不高的问题，提供一种高效、稳定的提取纯化方法。同时，本发明进一步验证了所得木犀草素在改善代谢相关脂肪性肝炎（mash）方面的显著效果，为其在医药领域的应用提供科学依据。

2、本发明的研究过程如下：先以马齿苋提取物为原料，依次经过大孔树脂分离富集、正相硅胶色谱分离纯化、中压制备色谱纯化、葡聚糖凝胶色谱纯化四个步骤，结合高效液相色谱（hplc）检测与纯度验证，最终获得纯度≥97%的木犀草素单体，经nmr鉴定确认其为木犀草素。随后构建mash动物模型，对正常对照组（nd）、模型组（mcd）、木犀草素干预组（mcd+lo）进行效果对比分析，木犀草素干预后可显著改善模型组中肝脏存在的大量脂肪性空泡结构、炎症细胞聚集情况，其甘油三酯（tg）、胆固醇（tc）水平和tnf-α、il-1β炎症因子水平也显著低于模型组，说明马齿苋来源的木犀草素对肝脏具有保护作用，可有效改善mash。

3、基于上述研究，本发明所要保护的技术方案如下：

4、本发明第一方面，提供一种马齿苋中木犀草素的高效提取纯化方法，该方法稳定高效，可获得纯度≥97%的木犀草素纯品，满足规模化生产需求。

5、优选的，上述所述的马齿苋中木犀草素的提取纯化方法如下：

6、s1、马齿苋提取物的制备：马齿苋干药材用50%的乙醇浸泡过夜，收集浸泡的溶液（4℃储存）；过滤得到的剩余粉末再用另一个新的50%乙醇溶液超声提取2h，重复提取2-3次；合并提取液并过滤，减压浓缩以去除乙醇，得到马齿苋提取物；

7、s2、大孔树脂吸附与解吸：将s1所得马齿苋提取物用水溶解，过滤后上样于活化的大孔树脂柱，吸附完全后，依次用水、60%乙醇、95%乙醇进行梯度洗脱，收集60%乙醇洗脱部位，浓缩得到粗纯品1；

8、s3、正相硅胶色谱纯化：将s2所得粗纯品1经正相硅胶柱色谱分离，以乙酸乙酯-甲醇系统进行梯度洗脱，薄层色谱（tlc）跟踪检测，收集含有木犀草素的组份，浓缩得到粗纯品2；

9、s4、中压制备色谱纯化：将s3所得粗纯品2用溶剂溶解过滤后，上样于c18中压制备色谱柱，以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，收集350nm下的目标峰馏分，浓缩得到纯度≥90%的粗纯品3；

10、s5、葡聚糖凝胶色谱纯化：将s4所得粗纯品3用溶剂溶解后，上样于葡聚糖凝胶色谱柱，用5%甲醇水溶液洗脱，收集350nm下的目标峰馏分，合并单一馏分，浓缩干燥，得到高纯度木犀草素，纯度≥97%。

11、进一步地，步骤s1中，进行超声提取时，采用50%乙醇在50~60℃条件下超声提取；进行减压浓缩时，提取液在50~60℃条件下减压回收溶剂，以防止溶剂爆沸。

12、进一步地，步骤s2中，所用的大孔树脂为d-101型，其活化方法包括用乙醇浸泡、洗脱至无醇味，并依次用酸、碱处理。具体活化方法优选如下：d-101大孔树脂用95%乙醇浸泡20~30h后湿法装柱，随后用95%乙醇洗脱至无醇味且洗脱液加水不浑浊，再用纯水冲洗至无醇味；然后依次用5% hcl浸泡4h，纯水洗至中性；2% naoh浸泡4h，纯水洗至中性，活化后保存在纯水中备用。

13、优选的，所述马齿苋提取物用水溶解后经0.45μm滤膜过滤，以20ml/min流速上样，4℃低温吸附。

14、进一步地，步骤s3中，所述的梯度洗脱程序如下：依次用乙酸乙酯：甲醇为40:1、25:1、20:1、15:1的梯度洗脱，tlc跟踪检测，合并含有木犀草素的组分，减压浓缩，得粗纯品2。

15、进一步地，步骤s4中，粗纯品2用60%甲醇溶解，0.45μm滤膜过滤；

16、所述c18中压制备色谱柱的柱温为30℃，检测波长350nm，流速20ml/min；

17、采用0.1%甲酸水溶液和甲醇分别作为a相和b相，进行梯度洗脱：0-5min，20% b；5-15min，20%-30% b；15-25min，30%-40% b；25-35min，40%-50% b；35-45min，50%-60% b；45-50min，60%-20% b；50-55min，20% b，收集350nm下的目标峰馏分，经检测验证后，合并含有目标物的组分，减压浓缩，得纯度≥90%的粗纯品3。

18、进一步地，步骤s5中，所述的葡聚糖凝胶为g-10，装柱前需用5%甲醇水溶液充分溶胀和洗涤后，对粗纯品3进行分离；

19、所述粗纯品3用5%甲醇水溶液溶解后，经0.45μm滤膜过滤后上样；用5%甲醇水溶液持续洗脱，收集350nm下的目标峰馏分；合并吸光度高、tlc荧光单一的馏分，40-60℃减压浓缩，冷冻干燥，得纯度≥97%的目标物纯品。

20、本发明第二方面，提供了马齿苋来源的木犀草素在制备预防或缓解mash药物或功能性食品中的应用。

21、优选的，所述改善代谢相关脂肪性肝炎（mash）体现在以下一个或多个方面：

22、a) 改善mash模型动物的肝脏脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变等mash病理情况；

23、b) 降低mash模型动物的甘油三酯（tg）或胆固醇（tc）水平；

24、c) 降低肝脏中tnf-α或il-1β促炎细胞因子水平。

25、本发明第三方面，提供了一种预防或缓解代谢相关脂肪性肝炎的药物组合物，其特征在于，以上述任一项所述方法提取纯化得到的木犀草素作为活性组分。

26、发明的作用与效果

27、本发明建立了一套从马齿苋中高效提取纯化木犀草素的完整工艺路线。该路线综合运用了大孔吸附树脂、正相硅胶、中压制备色谱和葡聚糖凝胶色谱技术，能够从含量极低的马齿苋提取物（约0.0122%）中成功分离出高纯度（≥97%）的木犀草素单体。该方法稳定、可靠，为木犀草素的规模化生产和药效研究提供了物质基础。

28、本发明首次验证了马齿苋来源的木犀草素在防治mash中的功效。实验结果显示，采用本发明提取方法制备得到的木犀草素能够改善肝脏脂肪变性、小叶炎症和肝细胞气球样变等mash肝脏病理情况，同时能够降低甘油三酯、胆固醇水平和tnf-α、il-1β炎症因子水平，改善mash脂质代谢和炎症反应。

29、本发明的马齿苋来源的木犀草素对mash具有显著的改善作用，可以用于制备防治mash的药品及功能性食品，具有广阔的开发利用前景。