用于检测幽门螺杆菌的方法和检验试剂盒与流程

背景技术：

1、本文提供了用于检测产生尿素酶的微生物，如幽门螺杆菌（helicobacterpylori/h. pylori）的方法和检验试剂盒。在一些实施例中，本文所提供的方法用于确定口腔粘膜活检样本中幽门螺杆菌的存在。

2、在许多病理（包括但不限于胃肠道病症和癌症）的诊断和管理中，确定幽门螺杆菌（原称弯曲杆菌）至关重要。1994年，幽门螺杆菌被认定为i类致癌物，并且目前被认为是感染相关癌症中最常见的病原体。约10%的幽门螺杆菌感染个体发展为消化性溃疡疾病，1%至3%发展为胃腺癌，并且不到0.1%发展为粘膜相关淋巴组织淋巴瘤（peterson, w. l.,1991；wroblewski等人, 2010；plummer等人, 2016）。

3、幽门螺杆菌生长在胃上皮上，并且不会穿透组织。它还存在于食管和十二指肠的组织中。它能在胃环境中增殖和存活，这归因于其产生尿素酶、其运动性以及能够附着于胃上皮等因素。尿素酶具有极高的比活性，并且是一种重要的毒力因子，其参与一系列使幽门螺杆菌能够定植于胃上皮并诱导胃上皮的强烈炎症反应的过程。幽门螺杆菌产生的尿素酶通过尿素水解释放氨，从而中和胃酸。

4、诊断幽门螺杆菌感染的手段有多种，包括粪便抗原检验、粪便聚合酶链反应（pcr）检验、尿素呼气检验、上消化道内窥镜检查以及组织样品活检。

5、目前可用的幽门螺杆菌诊断方法包括侵入性和非侵入性检验。侵入性检验（对通过内窥镜获得的活检组织进行病理学评估）具有较高的敏感性和特异性，并且可以通过活检组织培养对幽门螺杆菌菌株进行基因分型。然而，这些程序包括食管和/或胃穿孔及出血的风险和用于患者镇静的药物带来的风险，以及内窥镜程序和对活检样本进行病理学检查的高昂成本。

6、用于诊断幽门螺杆菌的非侵入性检验包括血清学检验、粪便抗原检验和尿素呼气检验。这些检验均具有较低的敏感性，并且因此无法准确诊断出幽门螺杆菌。尿素检验利用了幽门螺杆菌的尿素酶活性。将粘膜活检样本在含有尿素和ph敏感染料的培养基中温育（owen, r. j.等人, 1985）。幽门螺杆菌产生的尿素酶通过尿素水解释放氨，并且当产生的氨足够多以使培养基的ph升高时，染料会变色。

7、在美国专利第4,748,113号中描述并要求保护的名为clo检验的幽门螺杆菌商业检验可检测活检样本中的尿素酶活性。通过包括凝胶剂使温育培养基凝固。该培养基还含有酚红，当从尿素释放的氨使ph升高至6.0以上时，酚红变为粉红色。所述系统经过缓冲处理，因此被肠道中的流体污染的样本不会使ph升高并引起假阳性结果。当样本首次被插入到clo检验凝胶中时，如果存在血液或碱性胆汁，则样本可能呈现淡粉色。分析人员需记录样本的初始外观。只有当粉色的强度或面积增加时，检验才呈阳性。

8、clo检验需要在30℃下温育三小时，并在室温下另外进行至多21小时的温育。约75%感染幽门螺杆菌的活检样本在20分钟内呈现阳性结果，并且90%在3小时内呈阳性。需要二十四小时才能确认阴性结果，因为5%的感染样本会在3小时与24小时之间变为阳性。

9、传统的液体尿素酶检验使用几百微升培养基，并且阳性样本产生的氨通过扩散和机械搅拌与培养基混合。clo检验通过使用凝胶介质来减少机械搅拌，并且尿素酶活性较高的样本会在短时间内在样本附近产生红色。然而，弱阳性样本缓慢产生的氨扩散到整个凝胶中的时间较长，并且必须产生较多的氨才会引起变色。因此，随着样本的尿素酶含量的降低，变色所需的温育时间不成比例地增加。另外，检验介质中包括的用于消耗样本中的酸或碱的缓冲液抑制了由于氨的产生而导致的ph变化，这降低了测定敏感性并增加了温育时间。

10、pyloritek是另一种检验装置，美国专利第5,314, 804号和第5,420,016号。pyloritek检验试剂盒包括三个组成部分：第一，pyloritek含有试剂条，所述试剂条在单独的干燥试剂基质中具有底物尿素（底物垫）和ph指示剂（反应垫）。含有ph指示剂的反应垫被半透膜覆盖，所述半透膜允许气态氨穿过，但阻止胃组织液或水合试剂从底物垫穿过。第二，pyloritek检验试剂盒还含有水合试剂，所述水合试剂具有tris缓冲液，所述缓冲液在进行检验之前被分配到底物垫上。第三，pyloritek检验试剂盒含有一次性反应袋，从而在胃活检组织与底物垫之间提供紧密接触。这些确保了生成的氨被引导通过膜，然后到达ph指示剂。

11、然而，在该领域中，仍然需要用于检测患者体内的幽门螺杆菌感染的高效、成本有效且非侵入性的检验。本发明通过提供此类检验方法来满足这一需求。

技术实现思路

1、本文提供了用于检测用于检测口腔粘膜活检样本和/或内窥镜活检组织中的幽门螺杆菌感染的方法和检验试剂盒，其通过使用用于分离并优化所涉及的各种反应物的系统来检测由幽门螺杆菌产生的尿素酶的存在。在一些实施例中，首先将口腔粘膜活检样本定位在扩散元件的可透过氨的一侧。然后使口腔粘膜活检样本与尿素底物接触。如果样本中存在产生尿素酶的幽门螺杆菌，尿素就会转化为氨。然后，氨透过扩散元件，以与位于扩散元件的另一侧的反应垫接触。反应垫包括ph指示剂，当其与氨接触时，会产生可检测的反应（例如，颜色变化）。

2、一方面，本发明提供了一种用于检测口腔粘膜活检样本中的幽门螺杆菌感染的方法，所述方法包含：

3、(a)将所述口腔粘膜活检样本定位在扩散元件的能够透过氨的一侧；

4、(b)使所述口腔粘膜活检样本与包含尿素的底物垫接触，所述接触产生氨；

5、(c)使所述氨透过所述扩散元件，以与位于所述扩散元件的另一侧的反应垫接触；以及

6、(d)观察所述氨与所述反应垫的反应。

7、在一些实施例中，所述底物垫进一步包含水合试剂。

8、在一些实施例中，所述扩散元件是允许氨穿过但阻止口腔组织液或水合试剂通过的半透膜。

9、在一些实施例中，所述底物垫容纳在基质中。

10、在一些实施例中，所述反应垫包含ph指示剂。

11、在一些实施例中，所述ph指示剂包含溴酚蓝。

12、在一些实施例中，当氨与ph指示剂接触时，所述ph指示剂由黄色变为蓝色。

13、在一些实施例中，所述口腔粘膜活检样本放置在扩散元件上，并且底物垫放置在所述口腔粘膜活检样本上方以形成多层结构。

14、在一些实施例中，所述水合试剂为tris缓冲液。

15、在一些实施例中，所述tris缓冲液被分配到底物垫上。

16、在一些实施例中，所述基质为吸水纸。

17、在一些实施例中，所述基质中含有所述尿素。

18、另一方面，本发明提供了一种用于检测口腔粘膜活检样本中的幽门螺杆菌感染的方法，所述方法包含：

19、(a)将所述口腔粘膜活检样本定位在扩散元件的能够透过氨的一侧；

20、(b)使所述口腔粘膜活检样本与包含尿素的底物垫接触，其中在存在幽门螺杆菌的情况下，所述接触产生氨；以及

21、(c)观察所述氨与位于所述扩散元件的另一侧的反应垫是否发生反应，其中当所述氨透过所述扩散元件与所述反应垫接触时会发生反应，并且其中所述反应指示幽门螺杆菌感染。

22、一方面，本发明提供了一种用于检测口腔粘膜活检样本中的幽门螺杆菌感染的检验试剂盒，所述检验试剂盒包含：

23、(a)水合试剂；

24、(b)底物垫，所述底物垫包含尿素；

25、(c)扩散元件；

26、(d)反应垫；以及

27、(e)用于将所述口腔粘膜活检样本放置并维持在所述底物垫与所述扩散元件之间的装置。

28、在一些实施例中，所述扩散元件是允许氨穿过但阻止口腔组织液或水合试剂穿过的半透膜。

29、在一些实施例中，所述底物垫容纳在基质中。

30、在一些实施例中，所述反应垫包含ph指示剂。

31、在一些实施例中，所述ph指示剂包含溴酚蓝。

32、在一些实施例中，当氨与ph指示剂接触时，所述ph指示剂由黄色变为蓝色。

33、在一些实施例中，所述水合试剂为tris缓冲液。

34、在一些实施例中，所述tris缓冲液被分配到底物垫上。

35、在一些实施例中，所述基质为吸水纸。

36、在一些实施例中，所述基质中含有所述尿素。

37、在一些实施例中，与例如使用warthin-starry银染色液或苏木精和伊红的标准组织学检查相比，或与内窥镜程序相比，如本文所述的方法或检验试剂盒能够更准确地检测和/或以更高敏感性检测幽门螺杆菌感染。

38、在一些实施例中，与例如使用warthin-starry银染色液或苏木精和伊红的标准组织学检查相比，或与内窥镜程序相比，所述方法或所述检验试剂盒使得幽门螺杆菌感染检测的准确度增加。

39、在所述方法或所述检验试剂盒的一些实施例中，与例如使用warthin-starry银染色液或苏木精和伊红的标准组织学检查相比，或与内窥镜程序相比，准确度的增加和/或敏感性更高为增加约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、35%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更多。

40、在一些实施例中，所述方法或所述检验试剂盒用于预防胃癌和/或降低胃癌的风险，其中所述风险的降低为降低约1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、35%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%或更多。

41、在所述方法的一些实施例中，所述幽门螺杆菌感染通过组织学检查，例如warthin-starry银染色液或苏木精和伊红，或内窥镜程序来进一步确认。