基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法与流程

本发明属于基因检测，具体涉及一种基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法。

背景技术：

1、幽门螺旋杆菌（helicobacter pylori，h .pylori）是一种螺旋状弯曲革兰阴性杆菌，研究发现该菌为慢性胃炎、消化性溃疡的主要致病因素，而且与胃癌的发生和发展相关。根据世界卫生组织的流行病学调查结果，幽门螺杆菌存在于世界上超过50%的人的胃中，1994年，h .pylori被who列为ⅰ致癌因子。

2、幽门螺杆菌的核心基因组约含1100个基因，其中约200个为特有功能基因。其主要毒力相关基因包括caga、vaca、urea/b、baba2、dupa和omp基因。caga与多种胃部疾病密切相关，vaca通过破坏细胞线粒体功能导致细胞凋亡，在病理过程中起重要作用。ure基因帮助细菌在胃酸环境中生存，但变异少，难以区分菌株毒力差异。baba2和dupa基因与某些胃部疾病相关，但分布和表达差异大，相关性不如caga和vaca明确。omp基因家族成员多，变异大，分型复杂。因此，尽管这些基因在致病机制中重要，但因变异小、相关性不明确及检测复杂，其在常规基因分型中应用有限。

3、目前，幽门螺杆菌（h. pylori）可根据是否表达vaca和caga蛋白被分为两种类型：ⅰ型和ⅱ型。其中，ⅰ型菌株属于高毒力菌株，携带caga基因和/或vaca基因，并且能够表达这两种蛋白中的至少一种，从而产生空泡毒素（vaca）和细胞毒素相关蛋白（caga）中的至少一种毒素。而ⅱ型菌株则属于低毒力菌株，携带vaca基因，不携带caga基因，不表达caga蛋白及有活性的vaca蛋白‌。

4、caga基因的存在通常与高毒力菌株相关，但并非所有高毒力菌株均含有caga基因。vaca基因存在于所有幽门螺杆菌菌株中，其表达的vaca蛋白是一种细胞毒素，能够引起宿主细胞形成空泡，抑制t细胞增殖，诱导细胞凋亡。vaca基因具有多态性，主要分为信号序列（s区域）和中间序列（m区域），vaca基因型可以分为s1m1、s1m2、s2m1和s2m2四种亚型，s1m1、s1m2和s2m1基因型的vaca蛋白具有较强的细胞毒性，而s2m2基因型的vaca蛋白细胞毒性较弱，与较轻的疾病表现相关。依据以上内容，进行高毒株与低毒株基因片段比对，从而设计引物探针，区分高毒株与低毒株。

5、幽门螺杆菌分型检测在临床实践中具有重要意义。一是精准判断毒力及个体化治疗，i型菌株高毒力，建议对感染者进行根除治疗，无论是否有症状；ii型菌株低毒力，根据具体情况选择是否进行根除治疗。二是早期识别高风险人群，分型检测能够帮助早期识别高风险人群，尤其是胃癌高发人群，从而进行更精准的干预和治疗。三是避免抗生素滥用，通过分型检测，可以避免对低毒力菌株感染者进行不必要的根除治疗，减少抗生素的使用，降低耐药菌株的产生。五是合理分配医疗资源，分型检测有助于区分需要治疗的高毒力菌株感染者和无需治疗的低毒力菌株感染者，从而合理分配医疗资源。

6、因此，临床上对于幽门螺杆菌分型检测，有强烈的需求。然而目前主流的检测方法中，均存在明显局限性。首先，血清学抗体检测常用于幽门螺杆菌感染筛查，它无法准确判断患者是否处于当前感染状态，因抗体在体内持续时间长，即使感染已清除，抗体仍可被检测到，易致误诊。同时，该方法不能用于评估治疗效果，因抗体水平变化缓慢，无法及时反映治疗是否有效，难以提供实时反馈。此外，个体抗体反应差异影响检测准确性，且对早期感染检测敏感性低，易漏诊。因此，尽管其在初步筛查中有一定价值，但在需要准确判断感染状态和评估治疗效果时，应用受限。胃黏膜活检是诊断幽门螺旋杆菌感染的“金标准”，通过胃镜直接观察胃黏膜并在可疑部位取活检组织进行检测，能同时进行组织病理学检查和细菌培养。但组织病理学检查可能受染色技术和观察者经验影响，存在一定的主观性，且对早期或轻度感染可能漏诊；细菌培养虽准确性高，但操作复杂、耗时较长（通常需3-7天），对实验室条件要求严格，且受抗生素使用影响可能导致假阴性。但该方法作为一种有创的检测方法，可能给患者造成痛苦，不易被患者接受，也很难作为一种针对体检或健康人群的检测方法使用。qpcr检测作为分子生物学技术，通过扩增幽门螺旋杆菌的特定基因片段来判断感染，能在早期阶段检测到感染，其优势在于能精准识别感染类型。然而，当前市场上的qpcr试剂盒主要功能仅限于感染判定，缺乏针对高毒株和低毒株分型的检测能力。尿素呼气试验检测虽然快速，无创，但无法进行分型检测。粪便样本检测无需胃镜侵入操作，采样便捷，反映肠道定植真实状态，基质靶标丰度稳定，样本保存运输友好，停药后复查不受质子泵抑制剂、抗生素短期干扰，相比碳13/14呼气试验，停药等待周期更短，结果更稳定，适配毒力基因全面分型。但是粪便样本杂质多，核酸提取难度大，核酸抑制物含量高，强pcr抑制，易出现扩增曲线异常、ct 值延后、内标异常、假阴性等问题。导致目前没有基于粪便样本的幽门螺旋杆菌分型产品。综上，目前主流检测方法中没有无创且可同时进行现症感染和毒力分型的检测方法。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法。该方法基于粪便样本中提取的dna模板，通过针对性设计的引物探针组，进行多基因联合检测，具有无创、快速、简便、客观的特点，可采用闭管反应有效减少污染风险，高通量检测能力，非常适合在临床中大规模筛查及精准治疗导向；通过qpcr技术，检测过程可在1个工作日内完成。

2、本发明采用的技术方案是：一种基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，包括以下步骤：

3、步骤一、采集粪便样本，加入保存液稀释，研磨，提取纯化，制备dna模板；

4、步骤二、通过qpcr反应，采用引物探针组试剂对步骤一中制备的dna模板进行扩增，实时进行荧光检测，分析判定检测结果；所述引物探针组包括如seq id no:1、seq idno:2和seq id no:3所示核酸序列的上游引物，如seq id no:4、seq id no:5和seq id no:6所示核酸序列的下游引物，如seq id no:7、seq id no:8和seq id no:9所示核酸序列的荧光探针。

5、上述的基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，步骤一中所述保存液中包括三羟甲基氨基甲烷盐酸盐、edta-na2、nacl、tween-20、异丙醇和proclin 300。

6、上述的基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，步骤一中所述提取纯化方法包括煮沸法、离心柱法和磁珠法中任意一种。

7、上述的基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，步骤二中所述引物探针组还包括如seq id no:10所示核酸序列的上游引物，如seqid no:11所示核酸序列的下游引物，以及如seq id no:12所示核酸序列的atcb内标基因探针。

8、上述的基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，用于检测粪便样本中幽门螺旋杆菌核酸分型的基因分别为16s rrna、vaca和caga，seq id no:1、seq id no:4和seq id no:7为16s rrna序列，seq id no:2、seq id no:5和seq id no:8为vaca序列，seq id no:3、seq id no:6和seq id no:9为caga序列。

9、上述的基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，16s rrna的探针16s-p标记荧光基团为fam，vaca的探针vaca-p标记荧光基团为vic，caga的探针caga-p标记荧光基团为rox，atcb的探针atcb-p标记荧光基团为cy5，淬灭基团为bhq1、bhq2、tamra、dabcyl、mgb和eclipse中的任意一种。

10、上述的基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，各上游引物的浓度均为0.3μm，和各下游引物的浓度均为0.3μm，各荧光探针的浓度均为0.2μm。

11、上述的基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，步骤二中qpcr扩增的反应程序为：95℃，10min；95℃，15s；60℃，45s；循环45次。

12、上述的基于多基因联合无创检测粪便样本中幽门螺杆菌毒力分型的方法，其特征在于，所述检测结果可通过扩增曲线进行判定：

13、①若16s rrna扩增曲线起值，表明样本主体感染了幽门螺杆菌；在此基础上，若vaca和caga中至少有一条扩增曲线起值，判定为 hp高毒株感染；若vaca和caga的扩增曲线均不起值，判定为 hp 低毒株感染；

14、②若16s rrna扩增曲线不起值，表明样本主体未感染幽门螺杆菌。

15、本发明与现有技术相比具有以下优点：

16、1、本发明设计了基于多基因联合检测的幽门螺杆菌毒力分型方法，专门针对粪便样本中幽门螺杆菌的16s rrna、vaca及caga毒力基因设计了多组特异性强的引物探针组，能够克服粪便样本扩增核酸抑制物含量高，强pcr抑制的问题，实现对幽门螺杆菌16srrna、vaca和caga毒力基因的同时检测，对感染的幽门螺杆菌进行分型判定，且设置了检测内标atcb的引物探针组，各引物探针组在扩增时相互无影响，均能实现对特定检测对象的扩增，检测精度高。

17、2、本发明的方法可用于幽门螺杆菌感染的辅助诊断，能够助力临床制定更为精确的治疗策略，显著提升幽门螺杆菌的根除效率，进而有效遏制胃癌发病率的上升。

18、3、本发明针对vaca基因不同亚型（s1、s2、m1、m2）在毒力上的差异，深入对比了高低毒株的序列特征，并据此精确构建出针对高毒株vaca的特异性引物序列。针对caga基因，精选了含有该基因的高毒株菌株序列进行对比，筛选出了高度同源的序列片段，以此为模板进行了引物的特异性设计。同时，也为16s rrna设计了相应的引物，确保可特异性扩增幽门螺旋杆菌，与螺杆菌属其他菌株无交叉反应。并配备了专用的atcb内标基因引物，用于内标检测。各引物组在扩增时相互无影响，均能实现对特定检测对象的扩增，检测精度高；本技术设计的引物探针组，是针对粪便样本设计的，能够实现对粪便中幽门螺杆菌的qpcr扩增法检测，检测速度快，灵敏度高，成本也相对低廉。

19、4、本发明通过将粪便样本加入保存液稀释，研磨后提取纯化，制备dna模板，再结合引物探针组与扩增反应体系，实现了粪便样本中幽门螺旋杆菌的快速分型检测，有效规避了传统有创取样所带来的侵入性操作。

20、5、本发明的检测方法具有无创、快速、简便、客观的特点，可采用闭管反应有效减少污染风险，拥有高通量检测能力，非常适合在临床中大规模筛查及精准治疗导向。通过qpcr技术，检测过程可在1个工作日内完成，结果可信度高。这不仅提升了生物临床检测的整体水平，还为该技术的广泛应用提供了坚实基础。‌

21、6、本发明的引物探针组、试剂盒及检测方法可应用于pcr、qpcr、测序等技术领域，具有快速、简便、客观的特点，以及高通量检测能力，非常适合在临床中大规模筛查及精准治疗导向。这不仅提升了生物临床检测的整体水平，还为该技术的广泛应用提供了坚实基础。

22、7、本发明的检测方法为无创检测，操作十分便捷，1个工作日内就能获得检测结果，而且通过常用的荧光定量pcr检测设备，检测反应体系的荧光变化就能判断检测结果，适合大规模筛查与检测，十分适用于临床推广。

23、下面结合附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。