核酸扩增的增强剂的制作方法

本公开涉及核酸扩增的增强剂。本公开还涉及使用增强剂用于可能存在于样品中的靶核酸的扩增、检测和/或定量的方法。进一步提供了含有这些增强剂的反应混合物和试剂盒。

背景技术：

1、聚合酶链反应 (pcr) 是一种用于扩增 dna 和 rna 序列的强大实验室技术，该技术允许研究人员检测和研究特定基因或基因突变。该过程涉及加热和冷却的重复循环，以分别使 dna 链变性和退火，以及使用热稳定的 dna 聚合酶以延伸新合成的链。

2、虽然 pcr 为分子生物学中广泛使用的工具，但该工具可能易受干扰扩增过程的抑制剂的影响。pcr 抑制剂可以来源于各种来源，包括样品本身，诸如血液或土壤，或来源于在 dna 提取或 pcr 设置期间引入的污染物。作为实例，来自不同类别的抑制剂可以由hgdna、肝素和/或粘蛋白组成。抑制剂可以降低 pcr 效率或完全阻断扩增，从而导致假阴性或不确定性结果。此外，基于 pcr 的测试的测量系统能力（重复性、再现性和准确性）和灵敏度将受到负面影响。

3、为了克服 pcr 抑制剂，研究人员采用各种策略，包括稀释或纯化样品、修改反应条件，或使用添加剂以减少抑制。在一些情况下，可以使用专门的纯化试剂盒或方案去除抑制剂。

4、了解 pcr 抑制的潜在来源并且开发克服该问题的策略对于稳健的基于 pcr 的研究和诊断应用至关重要。有通过不同机制起作用的各种添加剂，这些添加剂可以用于提高 pcr 产率或克服抑制，包括牛血清白蛋白 (bsa)：一种可以减少 dna 聚合酶与反应中的其他组分或与反应管的壁的非特异性结合，并且可减少黑色素对 rt-pcr 的抑制的蛋白质，该蛋白质可以提高 pcr 特异性和产率（giambernardi 等人, biotechniques 25,564–6.）；dmso（二甲基亚砜）：一种可以帮助使 dna 模板中的二级结构变性、减少 pcr 抑制剂并且提高 pcr 产率的溶剂，但该溶剂在较高浓度下也可作为 dna 聚合酶的抑制剂（varadaraj 和 skinner, (1994) gene 140, 1–5）；甜菜碱：一种可以减少 dna 模板中的二级结构的形成，并且提高 pcr 效率（尤其是对于富含 gc 的模板）的化学物质（rees 等人 (1993) biochemistry 32, 137–44）；tween® 20、np-40 和 triton® x-100：可以通过减少 pcr 抑制剂与反应组分的结合来提高 pcr 灵敏度、从而克服即使是微量强离子型去污剂（诸如例如，sds）的抑制效应的非离子型去污剂（gelfand 等人 (1990) pcr protocols:a guide to methods and applications, 编, academic press, san diego, ca, 129–41）；甲酰胺：一种可以帮助减少 dna 模板中的二级结构、降低 dna 的解链温度、并且特别是在富含 gc 的模板中提高 pcr 产率的变性剂，但该变性剂在较高浓度下也可作为 dna聚合酶的抑制剂（varadaraj 和 skinner, (1994) gene 140, 1–5）；taqstart 抗体：一种可以结合并且抑制 taq 衍生的 dna 聚合酶非特异性扩增的抗体，该抗体可以在热启动pcr 应用中提高 pcr 特异性（kellogg, 等人 (1994) biotechniques, 16, 1134-1137）。因此，此类已知解决方案靶向材料的表面或 dna 的二级结构。dna 扩增反应本身的稳定化以及由此产生的变异减少、灵敏度提高和针对 dna 扩增反应的干扰的稳健性增加在本领域中未经描述，但应在下文中进行分析和呈现。本文中，本公开提供了可以在用于（增强）靶核酸的扩增的方法中使用的新型扩增增强剂。这在（生物）样品可能含有 pcr 抑制剂的情况下特别有用。

技术实现思路

1、如本文所公开的，令人惊讶地发现添加以下结构的分子可以提高核酸扩增的效率：

2、

3、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2、n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素。本文中，在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3和 r4 中的任一者可为 oh（即 r3 为 oh，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 oh），或者 r4 为 oh，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 oh））；并且如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h（即如果 r2 为 nh2，则 r3 为h，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 h），或者 r4 为 h，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 h））。

4、此外，如本文所公开的，令人惊讶地发现添加以下结构的分子可以提高核酸扩增的效率：

5、

6、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

7、本公开因此提供了一种用于扩增核酸的方法，该方法包括

8、(a) 使核酸与聚合酶、dntp、一组或多组对该核酸具有特异性的引物以及扩增增强剂接触，其中该扩增增强剂具有以下结构：

9、

10、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2、n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素。本文中，在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3和 r4 中的任一者可为 oh（即 r3 为 oh，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 oh），或者 r4 为 oh，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 oh））；并且如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h（即如果 r2 为 nh2，则 r3 为h，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 h），或者 r4 为 h，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 h））。

11、此外，本公开提供了一种用于扩增核酸的方法，该方法包括：(a) 使该核酸与聚合酶、dntp、一组或多组对该核酸具有特异性的引物以及扩增增强剂接触，其中该扩增增强剂具有以下结构：

12、

13、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

14、在一些实施例中，该方法进一步包括：

15、(b) 进行杂交步骤，其中该杂交步骤包括使来自步骤 (a) 的扩增产物与一个或多个探针接触；以及

16、(c) 进行检测步骤，其中该检测步骤包括检测与该核酸杂交的一个或多个探针。

17、在一些实施例中，扩增增强剂在步骤 (a) 中以 0.005% 至 0.1% (m/v)，优选0.01% 至 0.09% (m/v)，诸如 0.09% (m/v) 的浓度存在。

18、本公开还提供了一种用于增强核酸的扩增的方法，该方法包括在扩增增强剂的存在下扩增该核酸的步骤，其中该扩增增强剂具有以下结构：

19、

20、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2、n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素。本文中，在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3和 r4 中的任一者可为 oh（即 r3 为 oh，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 oh），或者 r4 为 oh，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 oh））；并且如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h（即如果 r2 为 nh2，则 r3 为h，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 h），或者 r4 为 h，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 h））。

21、此外，本公开还提供了一种用于增强核酸的扩增的方法，该方法包括在扩增增强剂的存在下扩增该核酸的步骤，其中该扩增增强剂具有以下结构：

22、

23、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

24、在一些实施例中，扩增核酸的步骤包括使该核酸与聚合酶、dntp 以及一组或多组对该核酸具有特异性的引物接触。

25、在一些实施例中，在扩增核酸的步骤中，扩增增强剂以 0.005% 至 0.1% (m/v)，优选 0.01% 至 0.09% (m/v)，诸如 0.09% (m/v) 的浓度存在。在一些实施例中，与在相同条件但没有扩增增强剂下的扩增相比，该扩增增强剂的存在导致核酸的更高效扩增。

26、本公开还提供了一种用于扩增核酸的试剂盒，该试剂盒包含如本文所公开的扩增增强剂。在一些实施例中，用于扩增核酸的试剂盒包含：

27、(a)一种或多种聚合酶；

28、(b)dntp；

29、(c)一组或多组对该核酸具有特异性的引物；以及

30、(d)扩增增强剂；

31、(e)以及任选地，一组或多组探针；

32、其中该扩增增强剂具有以下结构：

33、

34、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2、n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素。本文中，在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3和 r4 中的任一者可为 oh（即 r3 为 oh，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 oh），或者 r4 为 oh，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 oh））；并且如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h（即如果 r2 为 nh2，则 r3 为h，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 h），或者 r4 为 h，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 h））。

35、此外，本公开还提供了一种用于扩增核酸的试剂盒，其中扩增增强剂具有以下结构：

36、

37、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

38、在试剂盒的一些实施例中，扩增增强剂包含在组合物中，该组合物被配置为在核酸的扩增期间提供 0.005% 至 0.1% (m/v)，优选 0.01% 至 0.09% (m/v)，诸如 0.09%(m/v) 的扩增增强剂的最终浓度。

39、本公开还提供了一种用于扩增核酸的反应混合物，该反应混合物包含本文所公开的扩增增强剂。在一些实施例中，用于扩增核酸的反应混合物包含：

40、(a)一种或多种聚合酶；

41、(b)dntp；

42、(c)一组或多组对该核酸具有特异性的引物；

43、(d)扩增增强剂；

44、(e)该核酸

45、(f)以及任选地，一组或多组探针；

46、其中该扩增增强剂具有以下结构：

47、

48、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2、n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素。本文中，在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3和 r4 中的任一者可为 oh（即 r3 为 oh，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 oh），或者 r4 为 oh，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 oh））；并且如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h（即如果 r2 为 nh2，则 r3 为h，而 r4 为选自 r4 的列表的不同残基（即非 h），或者 r4 为 h，而 r3 为选自 r3 的列表的不同残基（即非 h））。

49、此外，本公开还提供了一种用于扩增核酸的反应混合物，其中扩增增强剂具有以下结构：

50、

51、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

52、在反应混合物的一些实施例中，扩增增强剂以 0.005% 至 0.1% (m/v)，优选0.01% 至 0.09% (m/v)，诸如 0.09% (m/v) 的浓度存在。聚合酶不受特别限制，包括 dna聚合酶、rna 聚合酶或逆转录酶。在一些实施例中，聚合酶是 dna 聚合酶。dntp 不受特别限制，包括天然存在的核苷酸和经修饰的核苷酸。天然存在的核苷酸包括例如 datp、dttp、dctp 和/或 dgtp。核酸的类型不受特别限制，但通常将为 rna 或 dna，优选 dna。核酸可以包含在生物样品或非生物样品中，优选包含在生物样品中。

53、r1 可以为 h、ch3、ch2ch3 或 ch2chohch2oh。在一些实施例中，r1 可以为 h、ch3 或ch2ch3。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3。在一些实施例中，r1 = ch3。

54、r2 可以为 oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2；n3 或卤素，其中 x = 1 或 2。在一些实施例中，r2 可以为 oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2；或卤素，其中 x = 1 或 2。在一些实施例中，r2 可以为 oh、o-烷基、n(烷基,h)x 或卤素，其中 x = 1 或 2。o-烷基中的烷基通常为c1-c3 烷基，诸如甲基、乙基、丙基或异丙基基团，优选甲基或乙基基团，更优选甲基基团(ch3)。当 r2 = o-烷基时，r1 优选为 ch3 或 ch2ch3，更优选 ch3。n(烷基,h)x 中的烷基通常为 c1-c3 烷基，诸如甲基、乙基、丙基或异丙基基团，优选甲基 (ch3) 或乙基 (ch2ch3)基团，更优选甲基基团 (ch3)。在一些实施例中，n(烷基,h)x 为 nh(烷基)。如果 r2 为nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h。当 r2 为 nh2 时，r3通常不为 h（在此类实施例中，r3 例如可以为 oh 或 ch3）。在一些实施例中，r2 可以为oh、o-烷基或 n(烷基,h)x。在一些实施例中，r2 = oh、nhch3 或卤素。在一些实施例中，r2 =oh 或 nhch3。在一些实施例中，r2 = oh。

55、r3 可以为 h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素。ch2/卤素、ch/卤素2或 c/卤素3 代表经卤素取代的甲基基团。在一些实施例中，r3 = h、oh 或 ch3。在一些实施例中，r3 = h 或 oh。在一些实施例中，r3 = oh 或 ch3。在一些实施例中，r3 = oh。

56、r4 可以为 h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素。ch2/卤素、ch/卤素2或 c/卤素3 代表经卤素取代的甲基基团。在一些实施例中，r4 = h、oh 或 ch3。在一些实施例中，r4 = h 或 oh。在一些实施例中，r4 = h。

57、本文中，在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 oh。

58、卤素可以选自例如 f、cl 和 br。优选地，卤素选自 f 和 br。当在扩增增强剂中存在多于一个卤素时，卤素可以独立地选自例如 f、cl 和 br，优选选自 f 和 br。当在扩增增强剂中存在多于一个卤素时，卤素也可以是相同类型的卤素。这通常将是经卤素取代的甲基基团的情况。例如，ch2/卤素、ch/卤素2 或 c/卤素3 可以分别为 ch2f、chf2 或 cf3，并且优选 cf3。

59、在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基) 或卤素，并且 r3 = h、oh 或ch3。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh 或 nh(烷基)，并且 r3 = h、oh 或 ch3。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh，并且 r3 = h、oh 或 ch3。在一些实施例中，r1 = ch3，r2 = oh，并且 r3 = h、oh 或 ch3。在一些实施例中，r1 = ch3，r2 = oh，并且 r3 = h 或oh。在一些实施例中，r1 = h，r2 = oh，并且 r3 = h、oh、f 或 cf3。

60、在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基) 或卤素，r3 = h、oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh 或 nh(烷基)，r3 = h、oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh，r3 = h、oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = ch3，r2 = oh，r3 = h、oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1= ch3，r2 = oh，r3 = h 或 oh，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h，r2 = oh，r3 = h、oh、f 或 cf3，并且 r4 = h。

61、在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基)、nh2 或卤素，并且 r3 = oh、ch3、cf3 或卤素。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基) 或卤素，并且 r3 =oh、ch3、cf3 或卤素。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh 或 nh(烷基)，并且 r3 =oh、ch3、cf3 或卤素。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基) 或卤素，并且 r3= oh 或 ch3。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基) 或卤素，并且 r3 = oh、f、ch3。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh 或 nh(烷基)，并且 r3 = oh 或 ch3。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh，并且 r3 = oh 或 ch3。在一些实施例中，r1 = ch3，r2= oh，并且 r3 = oh 或 ch3。在一些实施例中，r1 = ch3，r2 = oh，并且 r3 = oh。

62、在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基)、nh2 或卤素，r3 = oh、ch3、cf3 或卤素，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基) 或卤素，r3= oh、ch3、cf3 或卤素，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh 或 nh(烷基)，r3 = oh、ch3、cf3 或卤素，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基) 或卤素，r3 = oh、f、ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh、nh(烷基) 或卤素，r3 = oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh或 nh(烷基)，r3 = oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh，r3= oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = h 或 ch3，r2 = oh，r3 = oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = ch3，r2 = oh，r3 = oh 或 ch3，并且 r4 = h。在一些实施例中，r1 = ch3，r2 = oh，r3 = oh，并且 r4 = h。

63、在一些实施例中，扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、对茴香酸甲酯、4-氟-2-羟基苯甲酸甲酯、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基-2-甲基苯甲酸、4-氨基水杨酸、2-氟-4-羟基苯甲酸、4-羟基-2-(三氟甲基)苯甲酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、4-羟基-n,n-二甲基苯甲酰胺、4-乙酰氨基苯酚和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、对茴香酸甲酯、4-氟-2-羟基苯甲酸甲酯、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基-2-甲基苯甲酸、4-氨基水杨酸、2-氟-4-羟基苯甲酸、4-羟基-2-(三氟甲基)苯甲酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基水杨酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基水杨酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂选自 2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂选自 4-羟基-n,n-二甲基苯甲酰胺、4-乙酰氨基苯酚和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂为百里酚。

64、在一些实施例中，扩增增强剂不是对羟基苯甲酸甲酯。因此，在一些实施例中，该扩增增强剂选自 4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、对茴香酸甲酯、4-氟-2-羟基苯甲酸甲酯、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基-2-甲基苯甲酸、4-氨基水杨酸、2-氟-4-羟基苯甲酸、4-羟基-2-(三氟甲基)苯甲酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、4-羟基-n,n-二甲基苯甲酰胺、4-乙酰氨基苯酚和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂选自 4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、对茴香酸甲酯、4-氟-2-羟基苯甲酸甲酯、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基-2-甲基苯甲酸、4-氨基水杨酸、2-氟-4-羟基苯甲酸、4-羟基-2-(三氟甲基)苯甲酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂选自 4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基水杨酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂选自 4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基水杨酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂选自 4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸和 4-(甲氨基)苯甲酸。在一些实施例中，扩增增强剂选自2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂选自 2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂选自 2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。

65、在一些实施例中，包含在扩增增强剂中的碳原子数为 30 个或更少、25 个或更少、23 个或更少、20 个或更少、15 个或更少，诸如 14 个或更少、13 个或更少、12 个或更少、11 个或更少或 10 个或更少。

66、也可以组合使用两种或更多种增强剂。在一些实施例中，扩增增强剂为选自由以下各项组成的组中的两种或更多种增强剂的混合物：对羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、对茴香酸甲酯、4-氟-2-羟基苯甲酸甲酯、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基-2-甲基苯甲酸、4-氨基水杨酸、2-氟-4-羟基苯甲酸、4-羟基-2-(三氟甲基)苯甲酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、4-羟基-n,n-二甲基苯甲酰胺、4-乙酰氨基苯酚和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂为选自由以下各项组成的组中的两种或更多种增强剂的混合物：对羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、对茴香酸甲酯、4-氟-2-羟基苯甲酸甲酯、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基-2-甲基苯甲酸、4-氨基水杨酸、2-氟-4-羟基苯甲酸、4-羟基-2-(三氟甲基)苯甲酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂为选自由以下各项组成的两种或更多种增强剂的混合物：对羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基水杨酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂为选自由以下各项组成的两种或更多种增强剂的混合物：对羟基苯甲酸甲酯、4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基水杨酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂为选自由以下各项组成的两种或更多种增强剂的混合物：对羟基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚。在一些实施例中，扩增增强剂为选自由以下各项组成的两种或更多种增强剂的混合物：对羟基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。在一些实施例中，扩增增强剂为选自由以下各项组成的组中的两种或更多种增强剂的混合物：4-羟基苯甲酸、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、对茴香酸甲酯、4-氟-2-羟基苯甲酸甲酯、4-溴-2-羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸、4-(甲氨基)苯甲酸、4-氨基-2-甲基苯甲酸、4-氨基水杨酸、2-氟-4-羟基苯甲酸、4-羟基-2-(三氟甲基)苯甲酸、arm-43、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸乙酯。

67、当扩增增强剂为两种或更多种增强剂的混合物时，每种增强剂可以 0.005% 至0.1% (m/v)，优选 0.01% 至 0.09% (m/v)，诸如 0.09% (m/v) 的浓度存在。

68、除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管在本主题的实践或测试中，可使用与本文所述的那些方法和材料类似或等同的方法和材料，但下文描述了合适的方法和材料。此外，材料、方法和实例仅是说明性的，而不旨在限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用以其全文合并于本文。在发生冲突的情况下，以本说明书（包括定义）为准。

69、在本文所示的结构中，当并非原子的所有天然价均由指定的基团占据时，应理解为未占据的价由氢占据。当结构中的波浪线与键相交时，则相交的键是结构与分子其余部分连接的位置。

70、本发明的一个或多个实施例的细节在附图和以下说明书中阐述。本发明的其他特征、目的和优点将从附图和具体实施方式以及权利要求中显而易见。

71、本公开的示例性实施例如以下各项所述：

72、[1]一种用于扩增核酸的方法，该方法包括：

73、(a) 使核酸与聚合酶、dntp、一组或多组对该核酸具有特异性的引物以及扩增增强剂接触，其中该扩增增强剂具有以下结构：

74、

75、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2、n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素，其中在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和r4 中的任一者可为 oh；并且其中如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3和 r4 中的任一者可为 h；或者其中扩增增强剂具有以下结构：

76、

77、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

78、[2]根据项目 1 所述的方法，其进一步包括：

79、(b) 进行杂交步骤，其中该杂交步骤包括使来自步骤 (a) 的扩增产物与一个或多个探针接触；以及

80、(c) 进行检测步骤，其中该检测步骤包括检测与该核酸杂交的一个或多个探针。

81、[3]根据项目 1 或 2 所述的方法，其中聚合酶为 dna 聚合酶。

82、[4]根据前述项目中任一项所述的方法，其中 dntp 包括 datp、dttp、dctp 和dgtp。

83、[5]根据前述项目中任一项所述的方法，其中核酸为 rna 或 dna。

84、[6]根据前述项目中任一项所述的方法，其中核酸包含在生物样品中。

85、[7]根据项目 6 所述的方法，其中生物样品为身体样品，诸如血液、血浆或尿液。

86、[8]根据前述项目中任一项所述的方法，其中扩增增强剂的存在导致与在相同条件但没有扩增增强剂下的扩增相比，核酸的更快速扩增。

87、[9]根据前述项目中任一项所述的方法，其中 r1 = h 或 ch3，优选 ch3。

88、[10]根据前述项目中任一项所述的方法，其中 r2 = oh 或 nhch3，优选 oh。

89、[11]根据前述项目中任一项所述的方法，其中 r3 = h、oh 或 ch3，优选 oh 或ch3。

90、[12]根据前述项目中任一项所述的方法，其中 r4 = h、oh 或 ch3，优选 h。

91、[13]根据前述项目中任一项所述的方法，其中扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚或其任意组合。

92、[14]根据前述项目中任一项所述的方法，其中扩增增强剂为 2,4-二羟基苯甲酸甲酯。

93、[15]根据前述项目中任一项所述的方法，其中扩增增强剂为对羟基苯甲酸甲酯和2,4-二羟基苯甲酸甲酯的混合物。

94、[16]根据前述项目中任一项所述的方法，其中扩增增强剂在步骤 (a) 中以0.01% 至 0.09% (m/v) 的浓度存在。

95、[17]一种用于扩增核酸的试剂盒，该试剂盒包含：

96、(a)一种或多种聚合酶；

97、(b)dntp；

98、(c)一组或多组对该核酸具有特异性的引物；以及

99、(d)扩增增强剂；

100、(e)以及任选地，一组或多组探针；

101、其中该扩增增强剂具有以下结构：

102、

103、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2；n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素，

104、其中在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 oh；并且其中如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h；或者其中该扩增增强剂具有以下结构：

105、

106、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

107、[18]根据项目 17 所述的试剂盒，其中聚合酶为 dna 聚合酶。

108、[19]根据项目 17 或 18 所述的试剂盒，其中 dntp 包括 datp、dttp、dctp 和dgtp。

109、[20]根据项目 17 至 19 中任一项所述的试剂盒，其中核酸为 rna 或 dna。

110、[21]根据项目 17 至 20 中任一项所述的试剂盒，其中试剂盒是用于扩增包含在生物样品中的核酸。

111、[22]根据项目 21 所述的试剂盒，其中生物样品为身体样品，诸如血液、血浆或尿液。

112、[23]根据项目 17 至 22 中任一项所述的试剂盒，其中 r1 = h 或 ch3，优选ch3。

113、[24]根据项目 17 至 23 中任一项所述的试剂盒，其中 r2 = oh 或 nhch3，优选oh。

114、[25]根据项目 17 至 24 中任一项所述的试剂盒，其中 r3 = h、oh 或 ch3，优选oh 或 ch3。

115、[26]根据项目 17 至 25 中任一项所述的试剂盒，其中 r4 = h、oh 或 ch3，优选h。

116、[27]根据项目 17 至 26 中任一项所述的试剂盒，其中扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚或其任意组合。

117、[28]根据项目 17 至 27 中任一项所述的试剂盒，其中扩增增强剂为 2,4-二羟基苯甲酸甲酯。

118、[29]根据项目 17 至 28 中任一项所述的试剂盒，其中扩增增强剂为对羟基苯甲酸甲酯和 2,4-二羟基苯甲酸甲酯的混合物。

119、[30]根据项目 17 至 29 中任一项所述的试剂盒，其中扩增增强剂包含在组合物中，该组合物被配置为在核酸的扩增期间提供 0.01% 至 0.09% (m/v) 的扩增增强剂的最终浓度。

120、[31]一种用于增强核酸的扩增的方法，该方法包括在扩增增强剂的存在下扩增该核酸的步骤，其中该扩增增强剂具有以下结构：

121、

122、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2；n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素，

123、其中在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 oh；并且其中如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h；或者

124、其中该扩增增强剂具有以下结构：

125、

126、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

127、[32]根据项目 31 所述的方法，其中扩增核酸的步骤包括使该核酸与聚合酶、dntp 以及一组或多组对该核酸具有特异性的引物接触。

128、[33]根据项目 32 所述的方法，其中聚合酶为 dna 聚合酶。

129、[34]根据项目 32 或 33 所述的方法，其中 dntp 包括 datp、dttp、dctp 和dgtp。

130、[35]根据项目 31 至 34 中任一项所述的方法，其中核酸为 rna 或 dna。

131、[36]根据项目 31 至 35 中任一项所述的方法，其中核酸包含在生物样品中。

132、[37]根据项目 36 所述的方法，其中生物样品为身体样品，诸如血液、血浆或尿液。

133、[38]根据项目 31 至 37 中任一项所述的方法，其中扩增增强剂的存在导致与在相同条件但没有扩增增强剂下的扩增相比，核酸的更快速扩增。

134、[39]根据项目 31 至 38 中任一项所述的方法，其中 r1 = h 或 ch3，优选 ch3。

135、[40]根据项目 31 至 39 中任一项所述的方法，其中 r2 = oh 或 nhch3，优选oh。

136、[41]根据项目 31 至 40 中任一项所述的方法，其中 r3 = h、oh 或 ch3，优选 oh或 ch3。

137、[42]根据项目 31 至 41 中任一项所述的方法，其中 r4 = h、oh 或 ch3，优选 h。

138、[43]根据项目 31 至 42 中任一项所述的方法，其中扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚或其任意组合。

139、[44]根据项目 31 至 43 中任一项所述的方法，其中扩增增强剂为 2,4-二羟基苯甲酸甲酯。

140、[45]根据项目 31 至 44 中任一项所述的方法，其中扩增增强剂为对羟基苯甲酸甲酯和 2,4-二羟基苯甲酸甲酯的混合物。

141、[46]根据项目 31 至 45 中任一项所述的方法，其中扩增增强剂在扩增核酸的步骤中以 0.01% 至 0.09% (m/v) 的浓度存在。

142、[47]一种用于扩增核酸的反应混合物，该反应混合物包含：

143、(a)一种或多种聚合酶；

144、(b)dntp；

145、(c)一组或多组对该核酸具有特异性的引物；

146、(d)扩增增强剂；

147、(e)该核酸

148、(f)以及任选地，一组或多组探针；

149、其中该扩增增强剂具有以下结构：

150、

151、其中 r1 = ch3、h、ch2ch3 或 ch2chohch2oh；r2 = oh、o-烷基、n(烷基,h)x、nh2；n3或卤素，其中 x = 1 或 2；r3 = oh、h、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素；并且 r4 =h、oh、ch3、ch2/卤素、ch/卤素2、c/卤素3 或卤素，

152、其中在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 oh；并且其中如果 r2 为 nh2，则在同一个扩增增强剂结构中，仅 r3 和 r4 中的任一者可为 h；或者

153、其中该扩增增强剂具有以下结构：

154、

155、其中 r5 = nh-c(o)-ch3、c(o)-n(ch3)2 或 ch(ch3)2；r6 = h、oh 或卤素；r7 = oh或 ch3。

156、[48]根据项目 47 所述的反应混合物，其中聚合酶为 dna 聚合酶。

157、[49]根据项目 47 或 48 所述的反应混合物，其中 dntp 包括 datp、dttp、dctp和 dgtp。

158、[50]根据项目 47 至 49 中任一项所述的反应混合物，其中核酸为 rna 或 dna。

159、[51]根据项目 47 至 50 中任一项所述的反应混合物，其中该反应混合物用于扩增包含在生物样品中的核酸。

160、[52]根据项目 51 所述的反应混合物，其中生物样品为身体样品，诸如血液、血浆或尿液。

161、[53]根据项目 47 至 52 中任一项所述的反应混合物，其中 r1 = h 或 ch3，优选ch3。

162、[54]根据项目 47 至 53 中任一项所述的反应混合物，其中 r2 = oh 或 nhch3，优选 oh。

163、[55]根据项目 47 至 54 中任一项所述的反应混合物，其中 r3 = h、oh 或 ch3，优选 oh 或 ch3。

164、[56]根据项目 47 至 55 中任一项所述的反应混合物，其中 r4 = h、oh 或 ch3，优选 h。

165、[57]根据项目 47 至 56 中任一项所述的反应混合物，其中该扩增增强剂选自对羟基苯甲酸甲酯、2,4-二羟基苯甲酸甲酯、4-羟基-2-甲基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和百里酚或其任意组合。

166、[58]根据项目 47 至 57 中任一项所述的反应混合物，其中扩增增强剂为 2,4-二羟基苯甲酸甲酯。

167、[59]根据项目 47 至 58 中任一项所述的反应混合物，其中扩增增强剂为对羟基苯甲酸甲酯和 2,4-二羟基苯甲酸甲酯的混合物。

168、[60]根据项目 47 至 59 中任一项所述的反应混合物，其中扩增增强剂以 0.01%至 0.09% (m/v) 的浓度存在。