一种高产麦角硫因的灰树花工程菌的发酵方法及其应用与流程

本发明属于微生物发酵领域，具体为采用一种高产麦角硫因的灰树花工程菌的发酵方法及其应用。

背景技术：

1、麦角硫因(ergothioneine，erg)是一种含硫醇的组氨酸衍生物，可保护细胞免受过量活性氧(ros)引起的氧化损伤，具有超强的抗氧化活性和清晰的抗氧化机理。erg在自然界中存在于微生物和植物，提取应用的erg主要来源于各种大型真菌，但含量低、提取纯化困难。近年来发展起来的合成生物学技术，使得erg的大量制造成为可能。

2、人和动物不能合成麦角硫因，只能通过膳食摄取；而持续补充足量的麦角硫因，能够通过增强体内抗氧化、抗炎和免疫能力从中获益。2013年发布的“饲料添加剂目录”中，抗氧化剂是作为其中的一个类别，具有维护动物健康、促进动物生长的功效，其中包括茶多酚、维生素e、抗坏血酸、没食子酸丙酯等。erg作为功能强大的抗氧化剂，应用于饲料中以提高动物的生产性能，尚未见报道。

3、专利201480018831.x公布了“含有麦角硫因的鸡蛋与产该鸡蛋的蛋鸡的饲料以及喂食饲养方法”，但并未说明饲料中麦角硫因的含量，也未载明对蛋鸡生长和蛋鸡生产能力的影响；专利201110460029.4公布了“麦角硫因的合成方法”，虽然在发明摘要里提到了“为动物饲料”的应用，但权利要求中并没有相应的条款， 技术实现要素： 和实施实例中也没有载明任何相关的内容。

4、此前，发明人构建了一株高产麦角硫因的灰树花工程菌(zl 2025102248993)，然而其产业价值尚未得到开发。

技术实现思路

1、本发明利用之前获得的高产麦角硫因的灰树花工程菌作为发酵菌，通过对发酵工艺的开发和优化，获得制备高含麦角硫因的固体发酵产物，并将其制备为有利于动物健康、生长，提高动物生产性能的饲料添加剂。具体的，本发明提供如下的技术方案：

2、本发明的第一个方面，提供一种高产麦角硫因的灰树花工程菌的发酵方法，所述灰树花工程菌是通过将gf_egt1、gf_egt2基因在灰树花菌中共同过表达获得，所述gf_egt1、gf_egt2基因的序列如seq id no.10-11所示。

3、在一种实施方式中，发酵包括以下条件：

4、培养基组成：玉米粉、豆粕粉和麸皮，其比例为4:2:4，另补充1％甲硫氨酸、吐温800.5％；含水量60％；

5、发酵条件：按10v/w％接种种子液，混匀，洁净车间内浅盘培养，维持料温24-28℃，空气湿度80％；物料长满菌丝后，每天开启臭氧发生器一次，室内臭氧浓度达到10ppm时关闭；发酵周期约10天。

6、在一种实施方式中，所述种子液的制备方法为：

7、培养基组成为：玉米粉2％，豆粕粉1％，蛋白胨0.25％，kh2po40.1％；

8、发酵条件：按5v/v％比例接种摇瓶或者一级发酵罐菌种；26℃，通气1.0v/v，搅拌250rpm；发酵周期：36-48小时。

9、本发明的第二个方面，提供根据上述发酵方法制备获得的灰树花工程菌发酵产物。

10、在一种实施方式中，发酵产物中麦角硫因含量达1.12％。

11、本发明的第三个方面，提供上述发酵方法或发酵产物在制备饲料添加剂中的应用。

12、在一种实施方式中，所述应用包括将发酵产物烘干后粉碎，制备为饲料添加剂。

13、在一种实施方式中，所述饲料添加剂用于提高动物的抗氧化能力和免疫力，提高动物的生产性能。

14、在一种实施方式中，所述动物为鸡或猪。

15、本发明的第四个方面，提供一种饲料添加剂，所述饲料添加剂中包含前述的发酵产物。

16、本发明的技术方案具有如下显著的进步：

17、1.本发明提供的方法，采用固体发酵产物而非液体发酵菌丝体制备饲料添加剂，是基于本发明相关的前期研究结果：菌丝体占比22％的固体发酵产物，其麦角硫因含量要高于纯的液体发酵菌丝体近5倍(11236.5vs 2252.7)。其原因可能在于，麦角硫因作为一种抗氧化剂，其合成水平受所处环境中氧分压的影响很大。

18、2.上述固体发酵培养基中，麸皮的占比很高，正是出于对物料通气性能的考虑：其一，灰树花固体发酵物料表面率先长成的的气生菌丝，容易结成薄膜菌皮，阻隔空气流动，不利于菌丝在物料内部生长透彻；其二，物料中菌丝长透，仍然需要一定维持的氧气浓度，刺激菌丝合成积累麦角硫因。

19、3.为发酵产物中能够更多合成积累麦角硫因，如上所述，申请人探索出了一种臭氧加压胁迫的方法。另外，培养基中加入甲基供体甲硫氨酸(0.1％)能够促进麦角硫因的合成，加入吐温80(0.5％)，是为了增加细胞膜透性。

20、4.本发明所提供的添加剂在鸡饲料中的添加量为0.2％，最终日粮中添加麦角硫因20mg/kg。饲喂试验结果表明，本发明所提供的添加剂能够显著提高饲料消化率和肉鸡的生长性能，具体表现在日增重显著提高，料肉比显著减低。添加剂对于鸡的其它血生化指标均无明显影响，但有可能改善动物肝脏功能或许有利。添加剂还能显著提高鸡血清总抗氧化活性，并显著降低丙二醛含量，说明显著提升了机体的抗氧化活性。添加后鸡的免疫球蛋白水平无显著变化，但主导驯化b细胞的法氏囊明显增大，预示添加剂能够增强鸡体液免疫的动员能力。

21、5.本发明所提供的添加剂在仔猪饲料中的添加量为0.5％，最终日粮中添加麦角硫因50mg/kg。添加剂对仔猪的采食量、日增重和料肉比都影响显著，能提升仔猪生长性能，同时降低了仔猪腹泻率和腹泻程度以及腹泻致死率。

22、综上，本发明提供一种高产麦角硫因的灰树花工程菌制备的饲料添加剂，具有创造性和新颖性；本发明所提供的饲料添加剂在鸡、猪上的应用，均取得了良好的促生长、保健康的有益效果。

1.一种高产麦角硫因的灰树花工程菌的发酵方法，其特征在于，所述灰树花工程菌是通过将gf_egt1、gf_egt2基因在灰树花菌中共同过表达获得，所述gf_egt1、gf_egt2基因的序列如seq id no.10-11所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵包括以下条件：

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述种子液的制备方法为：

4.根据权利要求1-3任一所述的发酵方法制备获得的灰树花工程菌发酵产物。

5.根据权利要求4所述的发酵产物，其特征在于，发酵产物中麦角硫因含量达1.12％。

6.根据权利要求1-3任一所述的发酵方法或权利要求4-5任一所述的发酵产物在制备饲料添加剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述应用包括将发酵产物烘干后粉碎，制备为饲料添加剂。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述饲料添加剂用于提高动物的抗氧化能力和免疫力，提高动物的生产性能。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述动物为鸡或猪。

10.一种饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂中包含权利要求4-5任一所述的发酵产物。