基于YF17D疫苗株构建的多价减毒活疫苗及其构建方法和应用

本发明属于病毒和疫苗制备，具体涉及一种基于yf17d疫苗株构建的多价减毒活疫苗及其构建方法和应用。

背景技术：

1、黄热病减毒活疫苗yf17d来源于野生型黄热病病毒（yellow fever virus, yfv）asibi株，隶属于黄病毒科黄病毒属。该疫苗株系通过对asibi野生株在小鼠及鸡胚组织中进行长期连续传代而获得的稳定减毒变异株。yf17d为单股正链rna病毒，基因组全长约为11kb，包括5′utr（5'非翻译区）、一个开放阅读框（orf）及3′utr（3'非翻译区）。该orf编码三种结构蛋白及七种非结构蛋白。其中，三种结构蛋白分别为衣壳蛋白（c蛋白）、前体膜蛋白（prm蛋白）和包膜蛋白（e蛋白）。yf17d与其野生型亲本株yfv asibi在全基因组水平上高度保守，仅存在少量核苷酸和氨基酸差异。该疫苗株经长期应用证实，可诱导持久免疫应答，并在全球范围内广泛使用。基于其复制能力稳定、免疫原性良好及遗传背景明确等特点，yf17d被开发为活病毒载体平台。

2、目前围绕yf17d的重组疫苗技术主要包括两类策略：一类为嵌合黄病毒疫苗策略，即通过将yf17d骨架中编码结构蛋白prm蛋白和e蛋白的基因替换为另一种黄病毒的对应基因，使重组病毒在保留yf17d复制体系的同时表达目标病毒的包膜抗原，从而诱导针对目标黄病毒的特异性免疫应答。另一类为外源基因插入表达策略，即在yf17d基因组特定位点插入异源抗原的编码基因，实现外源蛋白表达，使疫苗同时诱导针对yf17d及目标病原体的免疫反应。

3、克里米亚-刚果出血热病毒（crimean-congo hemorrhagic fever virus, cchfv）是一种高致病性蜱传病毒，可引起高病死率的严重出血热，被世界卫生组织列为重点病原体之一。目前尚无获准上市的cchfv疫苗。cchfv的核蛋白（np）是该病毒的主要结构蛋白之一，在病毒复制中起关键作用，且具有高度的保守性及较强的免疫原性，被公认为cchfv疫苗开发的关键靶抗原。

4、现有技术中，虽然yf17d载体平台已被用于表达多种外源抗原，但仍然存在以下技术空白和缺陷：首先，现有的yf17d重组疫苗主要包括黄病毒属内不同病毒的结构蛋白替换以及外源抗原插入表达两类技术路线。目前尚未见将cchfv抗原整合至yf17d骨架中的嵌合减毒活疫苗公开报道。第二，现有yf17d重组疫苗策略通常仅采用单一技术路径，即仅进行结构蛋白替换或仅进行外源基因插入表达，尚未见将结构蛋白同源替换策略与外源抗原插入表达策略在同一yf17d载体中协同应用的公开报道，外源基因与结构蛋白同时嵌合的策略是否存在基因组稳定性表达与病毒复制能力不兼容的问题，不得而知。第三，现有的yf17d重组疫苗策略通常采用单一技术路径，在多个保护性抗原的协同表达及多价疫苗构建方面缺乏成熟技术方案。

5、因此，本领域亟需一种能够克服上述技术空白和缺陷的新型多价疫苗，同时有效应对yfv、cchfv和/或tbev等高致病性病原体的减毒活疫苗。

技术实现思路

1、基于上述技术问题，以及cchfv流行区域常与黄热病毒（yfv）及蜱传脑炎病毒（tick-borne encephalitis virus，tbev）等虫媒病毒共流行，传统单病原疫苗策略难以满足复杂疫区的公共卫生需求的原因，本发明基于黄热病毒减毒活疫苗yf17d载体平台，构建了针对cchfv的多价候选疫苗。本发明将cchfv关键抗原np（核蛋白）整合至yf17d减毒活病毒载体中，得到17d-np疫苗，在诱导cchfv特异性免疫应答的同时保留yf17d对yfv的保护能力。进一步通过结构蛋白替换策略，将yf17d载体的prm蛋白和e蛋白替换为tbev（蜱传脑炎病毒）的对应蛋白，从而构建出可在单次接种后同时诱导针对克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白（cchfv np）、yfv（骨架）以及蜱传脑炎病毒prm蛋白（tbev prm）和蜱传脑炎病毒e蛋白（tbev e）免疫应答的17d-np-tbe三价嵌合疫苗。

2、具体而言，本发明的第一个目的是提供一种基于yf17d减毒疫苗株构建的17d-np嵌合重组病毒，所述17d-np嵌合重组病毒的基因组中含有克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白的编码基因，所述克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白的编码基因插入在yf17d c蛋白编码基因第75位核苷酸之后，并通过fmdv 2a的编码基因与下游的c蛋白编码基因连接。

3、在优选的方案中，所述17d-np嵌合重组病毒的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明的第二个目的是提供一种基于yf17d减毒疫苗株构建的17d-np-tbe嵌合重组病毒，所述17d-np-tbe嵌合重组病毒的基因组是将所述17d-np嵌合重组病毒的基因组中yfv的prm蛋白编码基因和e蛋白编码基因分别对应替换为tbev的prm蛋白编码基因和e蛋白编码基因得到。

5、在优选的方案中，所述17d-np-tbe嵌合重组病毒的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、本发明的第三个目的是提供所述嵌合重组病毒的构建方法，包括以下步骤：构建含有yf17d减毒疫苗株全长基因组cdna的感染性克隆质粒；将克里米亚-刚果出血热病毒核蛋白的编码基因插入至所述感染性克隆质粒的基因组中，获得重组感染性克隆i；将所述重组感染性克隆i线性化体外转录获得的rna电转染至宿主细胞，拯救获得17d-np嵌合重组病毒。

7、在优选的方案中，所述嵌合重组病毒的构建方法还包括以下步骤：将所述重组感染性克隆i的基因组中yfv的prm蛋白编码基因和e蛋白编码基因分别对应替换为tbev的prm蛋白编码基因和e蛋白编码基因，得到重组感染性克隆ii；将所述重组感染性克隆ii线性化体外转录获得的rna电转染至宿主细胞，拯救获得17d-np-tbe嵌合重组病毒。

8、本发明的第四个目的是提供所述17d-np嵌合重组病毒在制备用于同时预防黄热病毒和克里米亚-刚果出血热病毒感染的减毒活疫苗i中的应用。

9、在优选的方案中，所述减毒活疫苗i的给药方式为注射给药。

10、在优选的方案中，所述减毒活疫苗i用于人类或非人灵长类动物的免疫接种。

11、本发明的第五个目的是提供所述17d-np-tbe嵌合重组病毒在制备用于同时预防黄热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒和蜱传脑炎病毒感染的减毒活疫苗ii中的应用。

12、在优选的方案中，所述减毒活疫苗ii的给药方式为注射给药。

13、在优选的方案中，所述减毒活疫苗ii用于人类或非人灵长类动物的免疫接种。

14、本发明的第六个目的是提供一种药物组合物i，所述药物组合物i包含所述17d-np嵌合重组病毒，以及药学上可接受的载体或/和赋形剂。

15、在优选的方案中，所述药物组合物i为用于预防黄热病毒和克里米亚-刚果出血热病毒感染的双价减毒活疫苗。

16、本发明的第七个目的是提供一种药物组合物ii，所述药物组合物ii包含所述17d-np-tbe嵌合重组病毒，以及药学上可接受的载体或/和赋形剂。

17、在优选的方案中，所述药物组合物ii为用于预防黄热病毒、克里米亚-刚果出血热病毒和蜱传脑炎病毒感染的三价减毒活疫苗。

18、与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：

19、（1）单针免疫优势和多价保护能力：本发明提供的重组嵌合病毒同时采用外源基因插入和结构蛋白替换两种策略，不仅保留了yf17d单剂免疫即可诱导长期免疫的特点，同时17d-np嵌合重组病毒还能诱导针对yfv与cchfv的免疫反应，17d-np-tbe嵌合重组病毒还能诱导针对yfv、cchfv与tbev的免疫反应，实现了多价抗原同时表达以及单针免疫、无需多针接种的目的。

20、（2）安全性提高：本发明提供的嵌合重组病毒在小鼠模型中观察到较亲本株yf17d显著降低的神经毒性、神经侵袭性和内脏噬性。

21、（3）适用于大规模生产：本发明提供的嵌合重组病毒可在vero细胞中扩增，符合who疫苗生产标准。