一种海南柊叶种质鉴定的SSR分子标记及其应用

本发明涉及一种ssr分子标记，尤其涉及一种海南柊叶种质鉴定的ssr分子标记及其应用。

背景技术：

1、海南柊叶（phrynium hainanense t. l. wu et senjen）为竹芋科柊叶属多年生草本植物，是我国华南地区极具特色的经济植物，既是传统粽叶的核心原料，其叶又称海南粽叶、海南加冬叶等，兼具药用、观赏、生态固土等多重价值，常在橡胶林、槟榔园套种，产业应用前景广阔。海南柊叶野生资源与栽培种质类型丰富，在叶片大小、叶色、株型、产量等性状上存在显著遗传变异，开展种质资源精准鉴定、遗传多样性评价与优良单株筛选，对海南柊叶资源保护、品种鉴别及育种利用至关重要。

2、目前海南柊叶种质鉴定与评价主要依赖形态学性状，如株高、叶片形态、分蘖数、叶色深浅等。该方法易受植株生育期、栽培条件、环境气候等因素影响，存在鉴定周期长、准确性不稳定、表型易混淆等问题，难以实现早期、快速、精准的种质鉴别，无法满足大规模种质资源筛选与分子育种需求。海南柊叶主要分为黑柊叶与白柊叶两类种质。黑柊叶叶片颜色偏深、偏宽一些，商品品质优良，市场售价较高，药用价值突出；其生长喜阴湿、富有机质土壤，耐寒性差，植株生长速度缓慢，多为可重复使用粽叶。白柊叶叶片相对颜色偏浅、偏窄一些，丰产优势明显，市场价格低廉，药效相对平缓；该种质光照耐受度更高，兼具耐旱、耐贫瘠特性，生长势头旺盛，多为一次性使用粽叶。由于两个种质外观十分相似，肉眼不易区分，因此常常造成混淆，导致栽培时难以选择合适的种质，也不利于后期的正常出售，因此，将两个种质进行准确区分，对于海南柊叶的栽培和应用均有重要的意义。

3、ssr（简单重复序列）分子标记具有多态性高、稳定性好、共显性遗传、重复性强、检测便捷等优势，已成为植物种质鉴定、遗传多样性分析、dna指纹图谱构建及分子辅助育种的首选标记手段。相较于rapd、afld、snp等标记，ssr标记操作简便、扩增条带清晰、成本较低，更适合基层科研与育种单位推广应用。

4、当前柊叶分子生物学研究基础薄弱，基因组信息匮乏，基于转录组开发、可稳定用于柊叶种质鉴定的特异性ssr分子标记仍十分缺乏，尚未形成高效、统一、可规模化应用的ssr标记检测体系，严重制约了柊叶种质资源精准评价、品种真伪鉴别与分子育种工作的开展。因此，开发多态性高、特异性强、扩增稳定的柊叶ssr分子标记，建立快速准确的种质分子鉴定方法，具有重要理论价值与生产应用意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术中柊叶种质鉴定依赖表型、准确性低、周期长，以及特异性ssr标记匮乏等问题，本发明提供了一种海南柊叶种质鉴定的ssr分子标记及其应用，实现对柊叶种质快速、稳定、精准的分子鉴定。

2、本发明的第一个方面是提供一种引物对，所述引物对为ssr1、ssr2、ssr3、ssr5、ssr6、ssr7、ssr8、ssr9、ssr10、ssr11、ssr12、ssr13、ssr14、ssr15、ssr16、ssr17、ssr18、ssr19或ssr21，各引物对的序列如下所示：

ssr1

tctaagatcgggggtgcat

tgcatttggattggtggcaa

ssr2

tgagcaagacgacgatcaag

tggtgcagatcaattacgca

ssr3

cttcggcgactccaatgtg

tggtgacccttcatcacaag

ssr5

gccatacacgggaaaggtaa

gaggagcacagcgtaaatgg

ssr6

aaagaagctccagctcaaaatag

gtgggaaggaagagagttgatg

ssr7

ccttcaccgacttcgtcgt

tccgcaaatcgaggatcagt

ssr8

cgtctccattctccgaacc

tgggaggagatcttgacgga

ssr9

gaaacccgactgggttactg

atctccggtatccacaccc

ssr10

gtcatccactccgattccag

ttatgcccgaatcgcttcac

ssr11

ctgctcatcatctctggctc

ccgaaagctatcccacaaca

ssr12

tattaacctgttgagctcgtcg

aaattgcaagctccgacaac

ssr13

caagcgaaaagttgaggtgc

tgggaaagtgagatccaggt

ssr14

atcgatcagcggatcacgaa

ccacacgcatcaagaacagt

ssr15

tgttgtagatcctcttcaggtg

ggcaaaggtgaagaatgtcg

ssr16

ccatgatcaccatccagtcc

aagcatgagacaagaacatgaac

ssr17

gcagatcttagcagaagaacg

gaatgcgggaaaggaacctg

ssr18

tcgatgccacaacattcaca

catcaaggagtcgtttggga

ssr19

aggtaccctgctcaactctt

tacccataagactcaccggc

ssr21

aagagacacacacagagggac

ggaattattgacgaagcagagag

3、。

4、本发明的第二个方面是提供一种引物组，所述引物组由引物对ssr1、ssr2、ssr3、ssr5、ssr6、ssr7、ssr8、ssr9、ssr10、ssr11、ssr12、ssr13、ssr14、ssr15、ssr16、ssr17、ssr18、ssr19和ssr21中的两对或两对以上组成，各引物对的序列如下所示：

ssr1

tctaagatcgggggtgcat

tgcatttggattggtggcaa

ssr2

tgagcaagacgacgatcaag

tggtgcagatcaattacgca

ssr3

cttcggcgactccaatgtg

tggtgacccttcatcacaag

ssr5

gccatacacgggaaaggtaa

gaggagcacagcgtaaatgg

ssr6

aaagaagctccagctcaaaatag

gtgggaaggaagagagttgatg

ssr7

ccttcaccgacttcgtcgt

tccgcaaatcgaggatcagt

ssr8

cgtctccattctccgaacc

tgggaggagatcttgacgga

ssr9

gaaacccgactgggttactg

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ssr10

gtcatccactccgattccag

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ssr11

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ssr12

tattaacctgttgagctcgtcg

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ssr13

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ssr14

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ssr15

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ssr16

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ssr17

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ssr18

tcgatgccacaacattcaca

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ssr19

aggtaccctgctcaactctt

tacccataagactcaccggc

ssr21

aagagacacacacagagggac

ggaattattgacgaagcagagag

5、。

6、优选地，所述引物组包括引物对ssr3和/或引物对ssr16。

7、本发明的第三个方面是提供如本发明第一个方面所述的引物对、或者如本发明第二个方面所述的引物组在区分黑柊叶和白柊叶中的应用。

8、本发明第四个方面是提供如本发明第一个方面所述的引物对、或者如本发明第二个方面所述的引物组在海南柊叶分子标记辅助育种中的应用。

9、本发明的第五个方面是提供一种区分黑柊叶和白柊叶的方法，采用本发明第一个方面所述的引物对、或者如本发明第二个方面所述的引物组进行。

10、优选地，所述方法包括以下步骤：提取待测柊叶dna，以此为模板，采用如本发明第一个方面所述的引物对进行pcr扩增，或者采用如本发明第二个方面或3所述的引物组分别进行pcr扩增，扩增产物采用琼脂糖凝胶进行检测分析。

11、如果采用引物对ssr1扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在313 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr2扩增出来的在316 bp左右的位置有明显亮带，则为黑柊叶，无明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr3扩增出来的在240 bp左右的位置有明显亮带，则为黑柊叶，在250 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr5扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在245 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr6扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在255 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr7扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在271 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr8扩增出来的在263 bp左右的位置有明显亮带，则为黑柊叶，无明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr9扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在239 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr10扩增出来的在222 bp左右的位置有明显亮带，则为黑柊叶，无明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr11扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在257 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr12扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在239 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr13扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在244 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr14扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在240 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr15扩增出来的在250 bp左右的位置有明显亮带，则为黑柊叶，无明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr16扩增出来的在245 bp bp左右的位置有明显亮带，则为黑柊叶，在255 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr17扩增出来的248 bp左右的位置有明显亮带，则为黑柊叶，无明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr18扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在230 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr19扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在331 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶；如果采用引物对ssr21扩增出来的无明显亮带，则为黑柊叶，在219 bp左右的位置有明显亮带，则为白柊叶。

12、本发明成功设计筛选出了19对引物对，均能够对黑柊叶和白柊叶材料dna进行验证，能够有效区分黑柊叶和白柊叶，实现对柊叶种质快速、稳定、精准的分子鉴定，重复性好、稳定可靠、检测快速。