一种抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法及特异性引物对

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法及特异性引物对。

背景技术：

1、辣椒（

capsicum annuuml.）是我国重要的经济作物，在四川等西南地区的农业生产中发挥着关键作用。然而，辣椒炭疽病（由炭疽菌属

colletotrichum spp.引起）是一种破坏性极强的真菌病害，在高温高湿环境下极易暴发流行。四川地区夏季雨热同期、湿度大、昼夜温差小，这一独特气候条件进一步加剧了炭疽病的发生与蔓延，严重时可导致辣椒大幅减产，果实品质和商品价值大幅下降，对辣椒产业造成巨大经济损失。

2、目前，培育抗病品种是防控辣椒炭疽病最经济、有效的根本途径，而抗病品种选育的成败，关键在于能否获得具有优良抗性且综合性状优异的骨干亲本材料。当前辣椒育种所用骨干亲本目前主要为遗传稳定、农艺性状整齐一致的高代自交系，骨干亲本材料不仅是优异基因的载体，更是决定杂交后代群体规模和筛选效率的核心基础。然而，辣椒炭疽病抗性遗传机制复杂，不同辣椒种质资源的抗性差异显著，国内外可供利用的兼具稳定抗病性与优良综合性状的高代自交系骨干亲本材料极为匮乏，已成为制约抗病育种效率提升的瓶颈。

3、现有技术中，辣椒炭疽病抗性鉴定主要依赖两种途径：一是田间自然发病条件下的表型观察，该法周期长、占用土地资源多，且抗性表现易受年度间气候差异、田间小气候及病原菌分布不均等因素影响，导致鉴定结果的准确性和重复性难以保证；二是人工接种鉴定，虽然环境条件可控，但操作繁琐、工作量大，难以在育种早期世代对大量单株进行大规模筛选。此外，国内外已报道的抗炭疽病辣椒资源多为地方品种或野生种，与栽培种的农艺性状差异较大，难以直接选育为可用的高代自交系骨干亲本，直接用作亲本往往需要多代回交转育，育种周期极为漫长。

4、近年来，分子标记辅助选择（mas）技术为作物抗病性鉴定提供了新的思路，但在辣椒炭疽病抗性领域，现有分子标记数量有限且特异性不足，难以准确区分抗病与感病基因型，更无法在育种早期对大量分离群体进行高效筛选。因此，开发一种能够快速、准确鉴定辣椒炭疽病抗性的特异性分子标记，并建立一套高效的筛选鉴定方法，对于挖掘和创制抗炭疽病优良高代自交系骨干亲本材料、加速辣椒抗病育种进程具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决上述现有技术问题，本发明提供一种鉴定辣椒炭疽病抗性的特异性引物对，以及利用该引物对进行抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，以提高抗性鉴定的准确性和筛选效率，为抗病育种提供优质种质资源。

2、本发明提供了如下技术方案。

3、一种鉴定辣椒炭疽病抗性的特异性引物对，包括核苷酸序列如seq id no.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物。

4、本发明还提供了如上所述的特异性引物对在鉴定抗炭疽病辣椒材料中的应用。

5、本发明还提供了一种抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，包括如下步骤：

6、取辣椒高代自交系为试材，栽培所述试材；

7、在炭疽病自然发病高峰期，提取所述试材的叶片的dna，使用如上所述的引物进行pcr扩增，对pcr产物进行凝胶电泳，以包含750bp片段的dna分子量标准为参照，将凝胶电泳中dna条带迁移位置与所述750bp片段迁移位置一致的材料赋值为1，其余赋值为0。

8、在其中一个实施例中，所述抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法还包括：所述试材的果实发病后，基于辣椒植株对炭疽病的抗性强弱，进行辣椒炭疽病抗性分级，抗性等级分为免疫、高抗、抗病、中抗、感病与高感；

9、对所述抗性等级为高抗的材料进行测序分析，与抗炭疽病材料参照品的基因序列进行对比，获得相似度；

10、结合所述赋值、所述抗性等级与所述相似度，筛选出抗炭疽病辣椒材料。

11、在其中一个实施例中，pcr扩增包括如下程序：

12、预变性阶段：将pcr反应体系置于94℃~98℃条件下保温1min~3min，执行1个循环；

13、循环扩增阶段：重复执行30~40个循环，每个循环包含：94℃~98℃下处理5s~15s，在如上所述的特异性引物对的tm值下退火5s~15s，所述tm值为58℃~62℃，然后在70℃~74℃下处理5s~15s；

14、延伸阶段：在70℃~74℃下保温3min~7min，执行1个循环；

15、保存阶段：将反应体系转移至4℃~10℃环境中保存。

16、在其中一个实施例中，凝胶电泳为琼脂糖凝胶电泳，电压为280v~320v，时间为15min~25min。

17、在其中一个实施例中，栽培所述试材包括如下步骤：穴盘育苗，3~5个月后定植，采用在网室内起垄开厢覆膜栽培，进行常规田间管理。

18、在其中一个实施例中，包含如下条件中的一种或多种：

19、（1）保温专用箱的材质为双面铝膜珍珠棉；

20、（2）育苗槽的底部和侧面的材质为双面铝膜珍珠棉；

21、（3）育苗槽的顶部开放，放在钢制的苗床上；

22、（4）育苗槽的高度为20cm~30cm。

23、在其中一个实施例中，定植采用的是双行单株定植，株距35cm~45cm。

24、在其中一个实施例中，定植后所施用的肥料中不包含中微量元素。

25、在其中一个实施例中，初花期所施用的肥料包含平衡型水溶肥与高钾型，膨果期所施用的肥料包含高钾型水溶肥与中氮中钾型，盛果期所施用的肥料包含高钾型水溶肥与平衡型水溶肥。

26、本发明的有益效果体现在，

27、本发明的特异性引物对可特异性扩增辣椒ca05g17730基因的特征片段，能准确区分抗病材料与感病材料，为辣椒炭疽病抗性的分子鉴定提供了高效工具，且扩增效率高、特异性强。

28、本发明建立的筛选与鉴定方法结合分子标记鉴定与田间表型观察，通过定植后不施中微量元素创造胁迫环境，促进感病材料发病，提高了抗性鉴定的区分度；同时，分子标记可在苗期早期鉴定，缩短筛选周期，减少环境干扰，提高筛选准确性和效率。进一步地，穴盘育苗采用双面铝膜珍珠棉保温专用箱和育苗槽，可实现冬季节能保温、夏季隔热，提高出苗整齐度和壮苗率，减少因幼苗生长差异导致的筛选误差，保证试验重复性。

29、通过本发明的筛选鉴定方法所筛选出的抗炭疽病辣椒材料农艺性状优良，适合四川等高温高湿地区种植，为辣椒抗炭疽病育种提供了优质种质资源。

1.一种鉴定辣椒炭疽病抗性的特异性引物对，其特征在于，包括核苷酸序列如seq idno.1所示的上游引物和核苷酸序列如seq id no.2所示的下游引物。

2.如权利要求1所述的特异性引物对在鉴定抗炭疽病辣椒材料中的应用。

3.一种抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，其特征在于，所述抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法还包括：所述试材的果实发病后，基于辣椒植株对炭疽病的抗性强弱，进行辣椒炭疽病抗性分级，抗性等级分为免疫、高抗、抗病、中抗、感病与高感；

5.根据权利要求3所述的抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，其特征在于，pcr扩增包括如下程序：

6.根据权利要求3所述的抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，其特征在于，栽培所述试材包括如下步骤：穴盘育苗，3~5个月后定植，采用在网室内起垄开厢覆膜栽培，进行常规田间管理。

7.根据权利要求6所述的抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，其特征在于，穴盘育苗包含如下条件中的一种或多种：

8.根据权利要求6所述的抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，其特征在于，定植采用的是双行单株定植，株距35cm~45cm。

9.根据权利要求6所述的抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，其特征在于，定植后所施用的肥料中不包含中微量元素。

10.根据权利要求9所述的抗炭疽病辣椒材料的鉴定与筛选方法，其特征在于，初花期所施用的肥料包含平衡型水溶肥与高钾型，膨果期所施用的肥料包含高钾型水溶肥与中氮中钾型，盛果期所施用的肥料包含高钾型水溶肥与平衡型水溶肥。