一种用于鉴别柱花草叶片氮磷比性状的SNP分子标记的应用

本发明涉及植物分子标记辅助育种和分子生物学，尤其涉及一种用于鉴别柱花草叶片氮磷比性状的snp分子标记的应用。

背景技术：

1、植物体内氮磷营养的平衡状态是其适应土壤养分胁迫的重要生理基础。在我国南方热带、亚热带广泛分布的酸性土壤中，有效磷极度匮乏而氮素相对充裕，这种养分供给失衡导致植株磷素获取不足、氮素相对富余，叶片氮磷比（n/p比）大幅偏离适宜生理区间。n/p比异常升高不仅反映磷素亏缺程度，更预示着氮磷代谢协同失调及碳氮资源配置效率下降，最终造成生长受抑和产量降低。因此，在酸性低磷土壤环境中，筛选能够维持适宜叶片n/p比、具备良好氮磷营养平衡调控能力的植物材料，对于挖掘边际土地生产潜力具有重要意义。

2、圭亚那笔花豆（

stylosanthes guianensis），俗名柱花草，其种质资源群体在酸性低磷胁迫下的氮磷平衡维持能力方面存在丰富的自然变异。作为我国南方重要的多年生豆科牧草和绿肥作物，柱花草具有较强的耐酸、耐铝及耐低磷能力，不同基因型在有效磷匮乏条件下的叶片n/p比分化显著：部分材料可通过协同调控根系养分吸收、体内转运分配及代谢通路适配，维持相对稳定的氮磷比值，表现出良好的营养平衡特性和逆境生长势；而另一些材料则n/p比严重失衡，养分利用效率与胁迫适应性明显下降。利用这一遗传变异挖掘叶片n/p比相关位点，对于培育养分高效型柱花草新品种具有重要价值。

3、叶片氮磷比是指单位干重叶片全氮含量与全磷含量之比，是综合评价植株氮磷营养平衡状态、养分协同吸收效率及代谢调控能力的生理指标。相较于单一养分浓度，氮浓度与磷浓度比值更能敏感地反映植株在酸性低磷胁迫下的养分资源配置策略和生理适应机制。维持适宜氮浓度与磷浓度比值的柱花草材料通常具有更优的氮磷协同利用效率和酸性低磷土壤适应性，是营养平衡定向改良的重要目标。然而，该比值需分别独立测定氮、磷含量后计算获得，传统鉴定需在特定酸性土壤条件下开展田间试验，经样品采集、消解、氮磷分别测定及比值计算等步骤完成，操作繁琐、周期长、成本高，且田间环境波动易引入测定误差，难以满足大规模种质资源的高效筛选。

4、目前，针对柱花草叶片氮磷比性状的分子标记研究极为有限，尤其缺乏能够稳定区分高氮浓度与磷浓度比值和低氮浓度与磷浓度比值材料的snp分子标记，严重制约了该性状的遗传解析和分子标记辅助选择育种。因此，开发与柱花草叶片氮磷比性状稳定关联的snp分子标记，对于建立基因型快速筛选体系、加速氮磷营养平衡型柱花草种质的定向选育具有重要意义。

技术实现思路

1、本发明提供一种用于鉴别柱花草叶片氮磷比性状的snp分子标记的应用，以克服上述问题。

2、为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

3、本发明第一方面提供一种与柱花草叶片氮磷比相关的snp分子标记引物对在鉴定柱花草叶片氮磷比性状及筛选低叶片氮磷比或高叶片氮磷比柱花草种质中的应用，所述分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，其中在seq id no.1所示序列的第401位存在c/t碱基突变；

4、所述snp分子标记的snp位点命名为sgm.chr9:99155604，位于柱花草chr9染色体的第99155604 bp位置；

5、所述snp分子标记的引物对的核苷酸序列如seq id no.2和seq id no.3所示；

6、当所述snp分子标记位点的基因型为cc时，则判定为低叶片氮磷比柱花草种质；当所述snp分子标记位点的基因型为tt或ct时，则判定为高叶片氮磷比柱花草种质。

7、本发明第二方面提供一种包含所述snp分子标记引物对的试剂盒在鉴定柱花草叶片氮磷比性状及筛选低叶片氮磷比或高叶片氮磷比柱花草种质中的应用，当所述snp分子标记位点的基因型为cc时，则判定为低叶片氮磷比柱花草种质；当所述snp分子标记位点的基因型为tt或ct时，则判定为高叶片氮磷比柱花草种质。

8、本发明第三方面提供一种用于鉴别柱花草叶片氮磷比性状的方法，包括以下步骤：

9、s1、提取待测柱花草材料的基因组dna；

10、s2、采用所述snp分子标记引物对对待测柱花草的基因组dna进行pcr扩增，对扩增产物进行测序，检测待测柱花草材料中所述snp分子标记位点的基因型；

11、s3、根据基因型判定待测柱花草材料的叶片氮磷比性状：若基因型为cc，则判定为低叶片氮磷比柱花草种质；若基因型为tt或ct，则判定为高叶片氮磷比柱花草种质。

12、进一步地，所述pcr扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，循环35次；72℃延伸7 min。

13、本发明的有益效果是：

14、本发明开发了柱花草snp分子标记位点sgm.chr9:99155604，该位点对叶片氮磷比的解释率为9.36%，是调控植株氮磷营养平衡状态与代谢协同效率的重要功能位点。基于该位点设计的特异性引物，配合pcr扩增测序可快速、准确鉴定不同材料的基因型，从而实现对柱花草叶片氮磷比的早期筛选。仅需少量叶片组织即可在苗期实现氮磷平衡性状的早期鉴定。检测结果不受土壤养分梯度、气候条件及植株生育阶段的干扰，无需布置田间标准化种植试验。本发明操作简便、检测成本低、鉴定周期大幅缩短，提升了育种工作效率，为柱花草氮磷协同高效型品种的分子标记辅助育种提供了可靠的技术支撑，兼具重要的生理遗传研究价值与牧草品质改良产业应用价值。

1. 一种与柱花草叶片氮磷比相关的snp分子标记引物对在鉴定柱花草叶片氮磷比性状及筛选高叶片氮磷比或低叶片氮磷比柱花草种质中的应用，其特征在于，所述snp分子标记的核苷酸序列如seq id no.1所示，其中在seq id no.1所示序列的第401位存在c/t碱基突变；

2.一种包含权利要求1中所述snp分子标记引物对的试剂盒在鉴定柱花草叶片氮磷比性状及筛选高叶片氮磷比或低叶片氮磷比柱花草种质中的应用，其特征在于，当所述snp分子标记位点的基因型为cc时，则判定为低叶片氮磷比柱花草种质；当所述snp分子标记位点的基因型为tt或ct时，则判定为高叶片氮磷比柱花草种质。

3.一种用于鉴别柱花草叶片氮磷比性状的方法，其特征在于，包括以下步骤：

4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述pcr扩增程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸7 min。