一种板蓝根多糖抗肝癌活性的双细胞评价方法

本发明属于肿瘤相关生物材料检测与分析，具体涉及一种通过检测板蓝根多糖洗脱后巨噬细胞的时序转录响应，并结合肝癌细胞功能及gadd45b相关信号响应评价板蓝根多糖抗肝癌活性的双细胞评价方法。

背景技术：

1、板蓝根是常用的中药材之一，含有多种化学物质如：多糖、生物碱以及有机酸等。其中板蓝根多糖具有一定免疫调节和生物活性，在近年中也逐渐应用于炎症调节或者与肿瘤相关的研究当中。目前对于板蓝根多糖的研究大多以板蓝根多糖直接处理肿瘤细胞，并通过检测细胞活性、增殖能力或是凋亡来判断板蓝根多糖的作用而很少考虑巨噬细胞参与后的间接影响从而无法区别于板蓝根多糖对肿瘤细胞的直接作用和免疫细胞介导作用。

2、巨噬细胞受到外源刺激之后，并不是所有基因在同一时刻就发生改变，在一个培养终点上检测到如inos，cd86，tnf-α或il-6等炎症相关的基因表达水平并不能说明刺激物撤除后的细胞响应是否会继续保持下去，也无法反映出各个响应阶段之间的顺序性；此外，植物多糖当中也可能含有痕量的内毒素，这些内毒素也同样会引起巨噬细胞转录的变化，如果没有设置与之相当的内毒素量对照以及用多黏菌素b中和验证，则会把内毒素的作用误认为是板蓝根多糖自身的动作。

3、在用巨噬细胞条件培养液处理肿瘤细胞时，由于培养液中还会存在少量的板蓝根多糖或者脂多糖，在没有设置同样残留量直接作用的情况下无法判断是残留刺激物直接的作用还是通过巨噬细胞所起的作用，并且只看gadd45b，mekk4，mkk7和jnk的表达或磷酸化的同时改变，只能说明相关性而不能确定gadd45b是否参与到相应的信号及细胞效应之中。所以需要建立一个将刺激物洗脱、分时间窗响应检测、内毒素校正、条件培养液的功能评价结合gadd45b敲低和回补的板蓝根多糖抗肝癌活性评价的方法。

技术实现思路

1、针对上述缺陷，本发明提供如下技术方案：一种板蓝根多糖抗肝癌活性的双细胞评价方法，以板蓝根多糖脉冲处理raw264.7细胞，洗脱后分时检测egr1和nfkbia、irf1和cxcl10、tnfaip3和acod1，并分别作为早期响应、持续效应和反馈制动指标；收集0～6h、6～12h、12～18h及18～24h条件培养液作用于hepg2细胞，按照下式计算巨噬细胞介导效应：

2、；

3、并按照下式计算校正持续效应值：

4、；

5、其中，为刺激物对应的第时间窗对指标产生的巨噬细胞介导效应；，分别表示细胞活性抑制效应和促凋亡效应；，其中p表示板蓝根多糖，l表示等内毒素量脂多糖；，依次表示0～6h、6～12h、12～18h和18～24h时间窗；、、和依次为第时间窗内，刺激物处理raw264.7细胞所得条件培养液、未处理raw264.7细胞所得条件培养液、等残留量刺激物直接作用和空白培养对指标产生的效应值；当早期响应先出现、持续效应保持、反馈制动后出现，且和均大于零时，判定板蓝根多糖具有洗脱后保持的巨噬细胞介导抗肝癌活性。

6、进一步地，所述板蓝根多糖经板蓝根水提取液浓缩、醇沉、脱蛋白、透析或超滤以及冻干得到；复溶后测定其总糖含量、蛋白残留量、分子量分布和内毒素含量，并根据测得的内毒素含量确定等内毒素量脂多糖组的脂多糖加入量。

7、进一步地，所述板蓝根多糖的脉冲处理浓度为25μg/ml～200μg/ml，脉冲处理时间为6h；raw264.7细胞设置空白组、板蓝根多糖组、板蓝根多糖和多黏菌素b联合组以及等内毒素量脂多糖组，所述等内毒素量脂多糖组与板蓝根多糖组具有相同的内毒素活性单位；脉冲处理结束后，各组均使用磷酸盐缓冲液洗涤2次～3次，再加入等体积不含板蓝根多糖和脂多糖的新鲜完全培养液。

8、进一步地，在洗脱后0h、6h、12h、18h和24h分别终止平行培养孔的培养，采用实时荧光定量pcr检测egr1、nfkbia、irf1、cxcl10、tnfaip3和acod1的mrna表达量，以actb为内参基因，采用法获得各基因相对于同时间点空白组的表达倍数。

9、进一步地，当egr1和nfkbia分别在洗脱后0h或6h达到相对表达倍数不低于1.5或不高于0.67时，将其确定为早期响应；当irf1和cxcl10分别在6h、12h和18h中的至少两个连续时间点保持相同变化方向，且其大于等内毒素量脂多糖组同时间点的相应值时，将其确定为持续效应；当tnfaip3和acod1首次达到所述表达倍数的时间晚于所述持续效应开始时间时，将其确定为反馈制动。

10、进一步地，分别收集洗脱后0～6h、6～12h、12～18h和18～24h的raw264.7细胞培养上清，每次收集后补加等体积新鲜完全培养液；所述培养上清经离心和0.22μm滤膜过滤后，按照20vol%～50vol%的比例加入hepg2细胞培养体系并作用24h～48h；每一时间窗均设置常规培养组、未处理raw264.7细胞条件培养液组、等残留量板蓝根多糖直接作用组、板蓝根多糖处理raw264.7细胞条件培养液组、等残留量脂多糖直接作用组和等内毒素量脂多糖处理raw264.7细胞条件培养液组；所述等残留量由接受相同脉冲处理、洗涤、换液和分段收集操作的无细胞对照孔确定。

11、进一步地，选取与irf1和cxcl10持续效应对应的时间窗条件培养液处理hepg2细胞，在相同培养终点由平行培养孔分别取得核酸样本和蛋白样本；采用实时荧光定量pcr检测gadd45b、map3k4、map2k7和mapk8的mrna表达量，采用免疫印迹法检测gadd45b、mekk4、mkk7和jnk的总蛋白水平以及mkk7和jnk的磷酸化水平，并分别计算磷酸化mkk7与总mkk7的灰度比值以及磷酸化jnk与总jnk的灰度比值。

12、进一步地，采用cck-8法检测hepg2细胞活性，采用tunel染色检测hepg2细胞凋亡水平，并采用克隆形成实验验证长期增殖能力；细胞活性和克隆形成结果按照下式转换为抑制效应值：；

13、tunel阳性率按照下式转换为促凋亡效应值：；

14、其中，为相应处理组检测值，为常规培养组检测值；将各时间窗经cck-8法得到的抑制效应值和经tunel染色得到的促凋亡效应值，按照处理组类型分别赋予、、和，依次代入所述巨噬细胞介导效应计算式和所述校正持续效应值计算式，获得细胞活性校正持续效应值和凋亡校正持续效应值；克隆形成实验所得抑制效应值用于验证所反映的变化方向。

15、进一步地，选取irf1和cxcl10保持表达且细胞活性和凋亡的均为正值的时间窗条件培养液进行gadd45b干预验证；在hepg2细胞融合度达到50%～70%时，采用阳离子脂质转染试剂将终浓度为25nmol/l～100nmol/l的gadd45b特异性小干扰rna转染至hepg2细胞中，同时设置非靶向小干扰rna阴性对照；转染24h～48h后加入所述时间窗条件培养液，并采用实时荧光定量pcr和免疫印迹法验证gadd45b的mrna和蛋白敲低状态。

16、进一步地，在gadd45b敲低的hepg2细胞中转染不含所述小干扰rna识别序列的gadd45b表达载体，所述表达载体的用量为每个细胞0.5μg～2.0μg，并设置空载体对照；回补培养24h～48h后，检测gadd45b表达、mkk7和jnk磷酸化水平以及hepg2细胞活性和凋亡水平；当gadd45b敲低使所述信号响应和巨噬细胞介导效应减弱，而gadd45b回补使相应变化恢复时，判定所述洗脱后持续的抗肝癌活性具有gadd45b依赖性。

17、本发明的有益效果为：

18、1、本技术采用板蓝根多糖对raw264.7细胞进行脉冲处理，并在处理结束后洗涤去除外源刺激物，再按照不同时间点检测egr1、nfkbia、irf1、cxcl10、tnfaip3和acod1的表达变化，将巨噬细胞响应划分为早期响应、持续效应和反馈制动。相比仅在单一培养终点检测炎症或极化指标，本技术能够进一步反映刺激物撤除后细胞响应的发生顺序及持续过程，从而将短时刺激所引起的即时变化与洗脱后仍能保持的细胞状态改变区分开来，为评价板蓝根多糖的持续免疫调节作用提供具有时间连续性的检测依据。

19、2、本技术在板蓝根多糖用于细胞评价前，对其总糖含量、蛋白残留量、分子量分布及内毒素含量进行质量控制，并依据实测内毒素含量设置具有相同内毒素活性单位的脂多糖对照，同时结合多黏菌素b干预对响应结果进行校正。由此能够降低植物多糖样品中痕量内毒素对巨噬细胞转录响应造成的混杂影响，使板蓝根多糖自身作用与内毒素引起的炎症样响应得到进一步区分，提高不同批次样品及不同实验条件下评价结果的可靠性。

20、3、本技术进一步构建raw264.7细胞与hepg2细胞相衔接的双细胞评价体系，将洗脱后0～6h、6～12h、12～18h和18～24h不同时间窗获得的条件培养液分别作用于hepg2细胞，并同步设置未处理raw264.7细胞条件培养液组和等残留量刺激物直接作用组。通过扣除基础条件培养液作用以及各时间窗残留板蓝根多糖或脂多糖的直接作用，计算巨噬细胞介导效应及校正持续效应值，从而避免将残留刺激物直接抑制肝癌细胞的作用误认为巨噬细胞介导作用，使板蓝根多糖经巨噬细胞产生的间接抗肝癌效应能够得到更加独立和客观的评价。

21、4、本技术将raw264.7细胞的时序转录响应与hepg2细胞的功能变化及信号响应相结合，在持续效应对应时间窗内同步检测hepg2细胞活性、凋亡和长期增殖能力，并检测gadd45b、mekk4、mkk7和jnk相关表达以及mkk7、jnk磷酸化状态。由此不再仅依靠单一基因表达或单一细胞活性指标评价板蓝根多糖作用，而是将上游巨噬细胞时间响应、下游肝癌细胞表型变化和细胞内信号状态相互对应，有利于形成从免疫细胞持续响应到肿瘤细胞功能改变的多层次评价证据。

22、5、本技术在上述双细胞评价基础上进一步设置gadd45b特异性敲低和回补验证，通过比较gadd45b表达降低及恢复前后mkk7和jnk磷酸化水平以及hepg2细胞活性和凋亡的变化，判断持续性巨噬细胞介导效应对gadd45b的依赖关系。该设计能够由单纯观察gadd45b及相关信号同步变化的相关性分析，进一步转化为“敲低后效应减弱、回补后效应恢复”的干预验证，从而增强板蓝根多糖洗脱后持续抗肝癌效应及其相关信号机制评价的完整性和可信度。