一种稳定表达组织蛋白酶B的细胞系及在促进非洲猪瘟病毒复制中的应用

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种稳定表达组织蛋白酶b的细胞系及在促进非洲猪瘟病毒复制中的应用。

背景技术：

1、非洲猪瘟(african swine fever,asf)是由非洲猪瘟病毒(african swine fevervirus，asfv)感染引起的一种急性、烈性传染病，具有高致死率和高传染性，对全球养猪业构成重大威胁。野猪(如非洲疣猪)为天然宿主，无症状但长期带毒；家猪感染后死亡率近100％。asfv通过直接接触或媒介(如蜱虫、污染饲料)传播，主要靶向猪的免疫细胞(如巨噬细胞和单核细胞)。研究发现，非洲猪瘟病毒在脾脏中载量最高，通过抑制宿主细胞凋亡和干扰素反应，延长感染时间，形成“避风港”机制。

2、asfv属于虹彩病毒科(asfarviridae)的唯一成员，为大型双链dna病毒，直径约175-215纳米，基因组复杂且编码超过150种蛋白。由于asfv基因组复杂，灭活疫苗无效，减毒活疫苗存在毒力返强风险。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所的候选疫苗株(2019年)在实验室阶段显示保护效果，但尚未商业化。目前认为基因缺失活疫苗和亚单位疫苗是重点，但需解决体外培养系统稳定性及免疫持久性问题。asf的持续威胁凸显了病毒学与流行病学研究的紧迫性，未来需在基础研究和应用转化间建立更紧密的桥梁，以实现有效防控。因此，如何更好地抑制病毒蛋白的表达，是预防或控制病毒感染的一种有效途径。而促进病毒疫苗的生产和表达增效为预防或控制病毒感染也具有一定价值。

3、组织蛋白酶b(ctsb)在机体内具有多重生理功能，包括参与蛋白水解、自噬调控及免疫调节等过程。ctsb属于溶酶体半胱氨酸蛋白酶家族，主要参与细胞内蛋白水解过程，尤其在溶酶体降解受损细胞器、异常蛋白及病原体成分中起关键作用。ctsb还可通过激活自噬小体-溶酶体系统，介导细胞自噬过程。自噬不仅参与细胞稳态维持。

技术实现思路

1、基于上述技术问题，本发明发现过表达宿主ctsb基因，能显著升高非洲猪瘟病毒的结构蛋白p72和非洲猪瘟病毒mrna的表达含量，可以显著促进非洲猪瘟病毒的复制，可用于非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒疫苗的表达增效剂，促进非洲猪瘟病毒疫苗的生产增效，也可用于研究非洲猪瘟病毒复制机制、制备相关的生物制品等。具体包括以下内容：

2、第一方面，本发明提供了一种组织蛋白酶b在制备非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒疫苗的生产增效剂中的应用。

3、优选地，所述组织蛋白酶b为猪源组织蛋白酶b。

4、优选地，所述猪源组织蛋白酶b登陆号为：xm_005657266.3。

5、第二方面，本发明提供了一种促进组织蛋白酶b表达的试剂在制备非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒疫苗的生产增效剂中的应用。

6、优选地，所述试剂包括促进组织蛋白酶b表达的小分子化合物、组织蛋白酶b的过表达载体或组织蛋白酶b的过表达细胞系。

7、优选地，所述组织蛋白酶b的过表达载体是在pcdna3.4载体的多克隆位点的age i及ecorv酶切位点之间插入连接myc蛋白标签的组织蛋白酶b的基因序列构建获得。

8、优选地，所述组织蛋白酶b为猪源组织蛋白酶b。

9、优选地，所述猪源组织蛋白酶b登陆号为：xm_005657266.3。

10、优选地，所述组织蛋白酶b的过表达细胞系是将过表达组织蛋白酶b的慢病毒转染宿主细胞获得。

11、优选地，所述所述组织蛋白酶b的过表达细胞系的构建方法包括：

12、(1)构建带有myc标签及过表达猪源组织蛋白酶b基因的慢病毒质粒载体；

13、(2)将步骤(1)中构建的慢病毒质粒载体与包装载体，共转染hek-293细胞，获得过表达组织蛋白酶b的慢病毒；

14、(3)以步骤(2)构建的慢病毒感染宿主细胞，获得组织蛋白酶b的过表达细胞系。

15、优选地，所述组织蛋白酶b为猪源组织蛋白酶b。

16、优选地，所述猪源组织蛋白酶b登陆号为：xm_005657266.3。

17、优选地，所述步骤(1)中的包装载体为pspax2和pmd2.g。

18、优选地，所述步骤(1)中慢病毒质粒载体、pspax2、pmd2.g的质量比为2:1:1。

19、优选地，所述步骤(3)中将慢病毒感染宿主细胞后，加入嘌呤霉素进行筛选，得到组织蛋白酶b的过表达细胞系。

20、优选地，所述宿主细胞为ipam细胞。

21、相较于现有技术，本发明的有益效果是：

22、(1)本发明首次发现过表达ctsb，能够显著促进非洲猪瘟病毒的结构蛋白p72表达，提高非洲猪瘟病毒mrna的表达含量，可以显著促进非洲猪瘟病毒的复制，可用于制备非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒疫苗的生产增效剂，促进非洲猪瘟病毒疫苗的生产增效。

23、(2)本发明构建了一种稳定表达ctsb的ipam细胞系，为进一步研究ctsb基因在细胞内调控病原微生物复制的分子机制提供研究工具和材料。

24、(3)过表达ctsb的ipam细胞系可用于非洲猪瘟病毒疫苗的生产细胞系，促进非洲猪瘟病毒疫苗的生产；也可用于筛选抗非洲猪瘟病毒的药物，以及构建复制关键蛋白的非洲猪瘟缺失毒，并用于抗非洲猪瘟病毒感染的疫苗制作。

1.组织蛋白酶b在制备非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒疫苗的生产增效剂中的应用。

2.促进组织蛋白酶b表达的试剂在制备非洲猪瘟病毒或非洲猪瘟病毒疫苗的生产增效剂中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括促进组织蛋白酶b表达的小分子化合物、组织蛋白酶b的过表达载体或组织蛋白酶b的过表达细胞系。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组织蛋白酶b的过表达载体是在pcdna3.4载体的多克隆位点的age i及ecorv酶切位点之间插入连接myc蛋白标签的组织蛋白酶b的基因序列构建获得。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述组织蛋白酶b的过表达细胞系是将过表达组织蛋白酶b的慢病毒转染宿主细胞获得。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述所述组织蛋白酶b的过表达细胞系的构建方法包括：

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中的包装载体为pspax2和pmd2.g。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述步骤(1)中慢病毒质粒载体、pspax2、pmd2.g的质量比为2:1:1。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(3)中将慢病毒感染宿主细胞后，加入嘌呤霉素进行筛选，得到组织蛋白酶b的过表达细胞系。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述宿主细胞为ipam细胞。