用于保存细胞游离DNA的拓扑信息的文库制备和分析方法与流程

本文中公开了用于确定和分析dna双链体（例如细胞游离dna（cell-free dna，cfdna））拓扑信息以及构建测序文库以获得这样的拓扑信息的方法和系统。本公开内容的某些方面更具体地涉及用于构建用于确定和/或分析来自dna双链体（例如cfdna）的5’和3’突出端的dna文库的方法和系统。

背景技术：

1、细胞游离dna（cfdna）分子是存在于血流中的游离漂浮的双链dna分子（dsdna或双链体dna），其通常是细胞凋亡或坏死的结果，特别是在疾病（例如癌症）的背景下。这些降解的线性dna片段的长度通常为约50至300个碱基对。最常见的是，通过分析cfdna序列以鉴定癌症相关突变，从而在疾病进展的早期阶段测定cfdna以用于癌症筛查。

2、天然cfdna通常具有其中5’或3’末端突出于互补链，从而形成锯齿状末端（jaggedend）的dna末端。标准的dna测序方法只能够对具有平末端的dna进行测序，因此传统的测序技术涉及在传统双链文库构建的末端修复步骤期间去除这些天然拓扑结构（topology）。因此，关于cfdna中存在的任何锯齿状末端长度和序列、天然末端序列、空位（gap）和切口（nick）的所有信息，以及鉴定该信息与癌症诊断和癌症护理的任何可能相关性的机会均将丧失。

技术实现思路

1、本文中描述了用于确定细胞游离dna拓扑结构的方法，以及制备用于确定细胞游离dna拓扑结构的核酸构建体的方法。还描述了至少部分地基于确定的细胞游离dna拓扑结构来检测疾病的方法。

2、在一些实施方案中，用于确定细胞游离dna拓扑结构的方法包括：用肌苷碱基延伸细胞游离dna双链体的第一链的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端；将测序衔接子与细胞游离dna双链体连接；对细胞游离dna双链体的第一链进行测序以产生第一序列读出；通过一个或更多个处理器来确定第一序列读出中待被软剪切（soft-clip）的一个或更多个碱基；通过一个或更多个处理器来从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸相对应的碱基；以及通过一个或更多个处理器基于对细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端的长度或序列。该方法还可包括通过一个或更多个处理器基于细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端的长度或序列来检测疾病（例如癌症）的存在或不存在。

3、用于确定细胞游离dna拓扑结构的方法还可包括：将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接；用肌苷碱基延伸第二测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端；将第二测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第一链的5’末端连接，其中所连接的3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体第一链的5’肌苷延伸；通过一个或更多个处理器来确定待被软剪切的与第一序列读出的5’末端连接的一个或更多个碱基；通过一个或更多个处理器从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸相对应的碱基；以及通过一个或更多个处理器基于对细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，该方法还可包括通过一个或更多个处理器基于细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端的长度或序列来检测疾病的存在或不存在。在一些实施方案中，将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接包括：延伸细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端以提供3’延伸，其中第二测序衔接子包含与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸互补的3’突出端；以及将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸连接。在一些实施方案中，细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端使用相同碱基类型的核苷酸碱基进行延伸。

4、在上述方法的一些实施方案中，确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基包括将第一序列读出与参考序列进行比对，并鉴别第一序列读出的未比对上的部分（unaligned portion）。

5、在一些实施方案中，用于确定细胞游离dna拓扑结构的方法还包括对细胞游离dna双链体的第二链进行测序以产生第二序列读出；以及通过一个或更多个处理器来确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基。在一些实施方案中，确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基包括将第二序列与参考序列进行比对，并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第一序列读出和第二序列读出通过唯一分子标识符（umi）相关联。在一些实施方案中，确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基包括将第一序列与第二序列读出进行比对，并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基包括将第二序列与第一序列读出进行比对并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。

6、在上述方法的一些实施方案中，该方法还包括用肌苷碱基延伸细胞游离dna双链体的第二链的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端；将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体连接；通过一个或更多个处理器从第二序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第二链的3’肌苷延伸相对应的碱基；以及通过一个或更多个处理器基于对细胞游离dna双链体的第二链的3’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，该方法还包括通过一个或更多个处理器基于细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端的长度或序列来检测疾病的存在或不存在。

7、在上述方法的一些实施方案中，延伸细胞游离dna双链体的第一链的3’末端包括形成3’单一的肌苷突出端。在一些实施方案中，测序衔接子包含与3’肌苷突出端互补的3’胞嘧啶突出端。

8、在一些实施方案中，用于确定细胞游离dna拓扑结构的方法还包括扩增细胞游离dna双链体以将样品索引与细胞游离dna双链体连接。

9、在上述方法的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含样品索引。

10、在上述方法的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含umi。

11、在上述方法的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子是y形测序衔接子。在一些实施方案中，衔接子可以是y全长衔接子（例如，包含索引序列的y形衔接子）、短柄衔接子（stubby adapter）或发夹衔接子。

12、本文中还提供了制备测序构建体的方法，其包括将测序衔接子与细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端连接；用肌苷碱基延伸测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端；以及将测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第二链的5’末端连接，其中所连接的3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸。在一些实施方案中，将测序衔接子与细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端连接包括：延伸细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端以提供3’延伸，其中测序衔接子包含与细胞游离dna双链体的第一链的3’延伸互补的3’突出端；以及将测序衔接子与细胞游离dna双链体的第一链的3’延伸连接。在一些实施方案中，细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端使用相同碱基类型的核苷酸碱基进行延伸。

13、本文中还描述了用于确定细胞游离dna拓扑结构的方法，其包括：根据上述方法制备测序构建体；对细胞游离dna双链体的第二链进行测序以产生第一序列读出；通过一个或更多个处理器来确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基；通过一个或更多个处理器从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸相对应的碱基；以及通过一个或更多个处理器基于对细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，该方法还包括通过一个或更多个处理器基于细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端的长度或序列来检测疾病（例如癌症）的存在或不存在。在一些实施方案中，确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基包括将第一序列读出与参考序列进行比对，并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。

14、在用于确定细胞游离dna拓扑结构的方法的一些实施方案中，该方法还包括对细胞游离dna双链体的第一链进行测序以产生第二序列读出；以及通过一个或更多个处理器来确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基。在一些实施方案中，确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基包括将第二序列与参考序列进行比对，并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第一序列读出和第二序列读出通过唯一分子标识符（umi）相关联。在一些实施方案中，确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基包括将第一序列与第二序列读出进行比对，并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基包括将第二序列与第一序列读出进行比对并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。

15、在用于确定细胞游离dna拓扑结构的方法的一些实施方案中，该方法还包括将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接；用肌苷碱基延伸第二测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端；以及将第二测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第一链的5’末端连接，其中3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸。在一些实施方案中，该方法还包括对细胞游离dna双链体的第一链进行测序以产生第二序列读出；通过一个或更多个处理器来确定待被软剪切的与第二序列读出的5’末端连接的一个或更多个碱基；通过一个或更多个处理器从第二序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸相对应的碱基；以及通过一个或更多个处理器，基于对细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，该方法还包括通过一个或更多个处理器基于细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端的长度或序列来检测疾病的存在或不存在。在一些实施方案中，将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接包括将单一肌苷与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接，并将第二测序衔接子与单一肌苷连接。在一些实施方案中，测序衔接子包含与和细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接的肌苷互补的3’胞嘧啶突出端。在一些实施方案中，确定待被软剪切的与第二序列读出的5’末端连接的一个或更多个碱基包括将第二序列读出与参考序列进行比对，并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第一序列读出和第二序列读出通过唯一分子标识符（umi）相关联。在一些实施方案中，确定待被软剪切的与第二序列读出的5’末端连接的一个或更多个碱基包括将第二序列读出与第一序列读出进行比对，并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，确定待被软剪切的与第一序列读出的5’末端连接的一个或更多个碱基包括将第一序列读出与第二序列读出进行比对并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。

16、在上述方法的一些实施方案中，扩增细胞游离dna双链体以将样品索引与细胞游离dna双链体连接。

17、在上述方法的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含样品索引。

18、在上述方法的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含umi。

19、在上述方法的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子是y形测序衔接子。在一些实施方案中，衔接子可以是y全长衔接子（例如，包含索引序列的y形衔接子）、短柄衔接子或发夹衔接子。

20、在上述方法的一些实施方案中，细胞游离dna双链体获自疑似患有癌症的对象或确定为患有癌症的对象。

21、在任何上述方法的一些实施方案中，该方法还包括用抗癌治疗来治疗对象。

22、在任何上述方法的一些实施方案中，该方法还包括从对象中获得细胞游离dna双链体。

23、在任何上述方法的一些实施方案中，该方法还包括从液体活检样品中获得细胞游离dna双链体。在一些实施方案中，样品是液体活检样品，并且包括血液、血浆、脑脊液、痰、粪便、尿或唾液。在一些实施方案中，细胞游离dna双链体是循环肿瘤dna（circulatingtumor dna，ctdna）双链体。

24、在任何上述方法的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含扩增引物结合位点、流动池衔接子序列（flow cell adapter sequence）或基底衔接子序列（substrate adapter sequence）。

25、在任何上述方法的一些实施方案中，该方法还包括扩增细胞游离dna双链体的第一链和第二链。在一些实施方案中，扩增包括进行聚合酶链反应（pcr）扩增技术、非pcr扩增技术或等温扩增技术。

26、在任何上述方法的一些实施方案中，测序包括使用大规模平行测序（massivelyparallel sequencing，mps）技术、全基因组测序（whole genome sequencing，wgs）、全外显子组测序、靶向测序、直接测序或桑格测序技术（sanger sequencing technique）。在一些实施方案中，测序包括大规模平行测序，并且大规模平行测序技术包括下一代测序（nextgeneration sequencing，ngs）。在一些实施方案中，测序使用下一代测序仪进行。

27、在任何上述方法的一些实施方案中，该方法还包括通过一个或更多个处理器生成报告，所述报告显示以下的长度：细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端和/或细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端。在一些实施方案中，该方法还包括将报告传输至健康护理提供者。在一些实施方案中，报告通过计算机网络或对等连接（peer-to-peer connection）传输。

28、在任何上述方法的一些实施方案中，该方法还包括生成对象的基因组谱，所述基因组谱包含以下的长度：细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端和/或细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端。在一些实施方案中，对象的基因组谱还包含来自以下的结果：全面基因组谱分析（comprehensive genomic profiling，cgp）测试、基因表达谱分析测试、癌症热点组测试、dna甲基化测试、dna片段化测试、rna片段化测试、或其任意组合。在一些实施方案中，对象的基因组谱还包含来自基于核酸测序的测试的结果。

29、本文中还描述了这样的系统，其包含：一个或更多个处理器；以及存储器，所述存储器与一个或更多个处理器通信耦合并被配置成存储指令，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，使得所述系统：接收通过以下而获得的第一序列读出：用肌苷碱基延伸细胞游离dna双链体的第一链的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端，将测序衔接子与细胞游离dna双链体连接，以及对细胞游离dna双链体的第一链进行测序以产生第一序列读出；确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基；从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，所述指令还使得系统基于细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端的长度或序列来检测疾病（例如癌症）的存在或不存在。在一些实施方案中，第一序列读出还通过以下获得：将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接；用肌苷碱基延伸第二测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端；以及将第二测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第一链的5’末端连接，其中所连接的3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体第一链的5’肌苷延伸。

30、在上述系统的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，所述指令还使得系统基于细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端的长度或序列来检测疾病的存在或不存在。在一些实施方案中，将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接包括：延伸细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端以提供3’延伸，其中第二测序衔接子包含与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸互补的3’突出端；以及将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸连接。在一些实施方案中，细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端使用相同碱基类型的核苷酸碱基进行延伸。

31、在上述系统的一些实施方案中，第一序列读出中的一个或更多个碱基通过这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第一序列读出与参考序列进行比对，并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。

32、在上述系统的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：接收通过对细胞游离dna双链体的第二链进行测序获得的第二序列读出；以及确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基。在一些实施方案中，第二序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第二序列与参考序列进行比对，并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第一序列读出和第二序列读出通过唯一分子标识符（umi）相关联。在一些实施方案中，第一序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第一序列与第二序列读出进行比对并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第二序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第二序列与第一序列读出进行比对并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第二序列读出还通过以下获得：用肌苷碱基延伸细胞游离dna双链体的第二链的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端，并将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体连接。在一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：从第二序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第二链的3’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第二链的3’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端的长度或序列。

33、在上述系统的一些实施方案中，延伸细胞游离dna双链体的第一链的3’末端包括形成3’单一的肌苷突出端。在一些实施方案中，测序衔接子包含与3’单一的肌苷突出端互补的3’胞嘧啶突出端。

34、本文中还描述了这样的系统，其包含：一个或更多个处理器；以及存储器，所述存储器与一个或更多个处理器通信耦合并被配置成存储指令，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，使得所述系统：接收通过以下而获得的第一序列读出：将测序衔接子与细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端连接，用肌苷碱基延伸测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端，以及将测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第二链的5’末端连接，其中所连接的3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸；确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基；从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，所述指令还使得系统基于细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端的长度或序列来检测疾病（例如癌症）的存在或不存在。

35、在上述系统的一些实施方案中，将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接包括：延伸细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端以提供3’延伸，其中第二测序衔接子包含与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸互补的3’突出端；以及将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸连接。在一些实施方案中，细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端使用相同碱基类型的核苷酸碱基进行延伸。

36、在上述系统的一些实施方案中，第一序列读出中的一个或更多个碱基通过这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第一序列读出与参考序列进行比对，并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。

37、在上述系统的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：接收通过对细胞游离dna双链体的第二链进行测序获得的第二序列读出，并确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基。在一些实施方案中，第二序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第二序列与参考序列进行比对，并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第一序列读出和第二序列读出通过唯一分子标识符（umi）相关联。在一些实施方案中，第一序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第一序列与第二序列读出进行比对并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第二序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第二序列与第一序列读出进行比对并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第二序列读出还通过以下获得：将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接；用肌苷碱基延伸第二测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端；以及将第二测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第一链的5’末端连接，其中3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸。在一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：从第二序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接包括将单一肌苷与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接，并将第二测序衔接子与单一肌苷连接。在一些实施方案中，测序衔接子包含与和细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接的单一肌苷互补的3’胞嘧啶突出端。

38、在任何上述系统的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含umi。

39、在任何上述系统的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子是y形测序衔接子。在一些实施方案中，衔接子可以是y全长衔接子（例如，包含索引序列的y形衔接子）、短柄衔接子或发夹衔接子。

40、在任何上述系统的一些实施方案中，该系统还包括被配置成扩增细胞游离dna双链体以将样品索引与细胞游离dna双链体连接的核酸扩增器。在一些实施方案中，核酸扩增器是热循环仪。

41、在任何上述系统的一些实施方案中，细胞游离dna双链体获自疑似患有癌症的对象或确定为患有癌症的对象。

42、在任何上述系统的一些实施方案中，细胞游离dna双链体获自对象。

43、在任何上述系统的一些实施方案中，细胞游离dna双链体获自液体活检样品。

44、在任何上述系统的一些实施方案中，样品是液体活检样品，并且包括血液、血浆、脑脊液、痰、粪便、尿或唾液。

45、在任何上述系统的一些实施方案中，细胞游离dna双链体是循环肿瘤dna（ctdna）双链体。

46、在任何上述系统的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含扩增引物结合位点、流动池衔接子序列或基底衔接子序列。

47、在任何上述系统的一些实施方案中，该系统还包括被配置成扩增细胞游离dna双链体的第一链和第二链的核酸扩增器。在一些实施方案中，扩增包括进行聚合酶链反应（pcr）扩增技术、非pcr扩增技术或等温扩增技术。

48、在任何上述系统的一些实施方案中，系统还包括被配置成对细胞游离dna双链体的第一链和/或细胞游离dna双链体的第二链进行测序的测序仪。在一些实施方案中，测序仪被配置成用于大规模平行测序（mps）技术、全基因组测序（wgs）、全外显子组测序、靶向测序、直接测序或桑格测序技术。在一些实施方案中，测序仪被配置成用于大规模平行测序，并且大规模平行测序技术包括下一代测序（ngs）。在一些实施方案中，测序仪是下一代测序仪。

49、在任何上述系统的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统生成报告，所述报告显示以下的长度：细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端和/或细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端。在一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统将报告传输至健康护理提供者。在一些实施方案中，报告通过计算机网络或对等连接传输。

50、在任何上述系统的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统通过一个或更多个处理器生成对象的基因组谱，所述基因组谱包含以下的长度：细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端和/或细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端。在一些实施方案中，对象的基因组谱还包含来自以下的结果：全面基因组谱分析（cgp）测试、基因表达谱分析测试、癌症热点组测试、dna甲基化测试、dna片段化测试、rna片段化测试、或其任意组合。在一些实施方案中，对象的基因组谱还包含来自基于核酸测序的测试的结果。

51、本文中还描述了存储一个或更多个程序的非暂态计算机可读存储介质，所述一个或更多个程序包含指令，所述指令在由系统的一个或更多个处理器执行时，使得系统：接收通过以下而获得的第一序列读出：用肌苷碱基延伸细胞游离dna双链体的第一链的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端，将测序衔接子与细胞游离dna双链体连接，以及对细胞游离dna双链体的第一链进行测序以产生第一序列读出；确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基；从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，所述指令还使得系统基于细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端的长度或序列来检测疾病（例如癌症）的存在或不存在。

52、在上述存储介质的一些实施方案中，其中第一序列读出还通过以下获得：将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接；用肌苷碱基延伸第二测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端；以及将第二测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第一链的5’末端连接，其中所连接的3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体第一链的5’肌苷延伸。在一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，所述指令还使得系统基于细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端的长度或序列来检测疾病的存在或不存在。

53、在上述存储介质的一些实施方案中，将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接包括：延伸细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端以提供3’延伸，其中第二测序衔接子包含与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸互补的3’突出端；以及将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸连接。在一些实施方案中，细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端使用相同碱基类型的核苷酸碱基进行延伸。

54、在上述存储介质的一些实施方案中，第一序列读出中的一个或更多个碱基通过这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第一序列读出与参考序列进行比对，并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。

55、在上述存储介质的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：接收通过对细胞游离dna双链体的第二链进行测序获得的第二序列读出，并确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基。在一些实施方案中，第二序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第二序列与参考序列进行比对，并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第一序列读出和第二序列读出通过唯一分子标识符（umi）相关联。在一些实施方案中，第一序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第一序列与第二序列读出进行比对并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第二序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第二序列与第一序列读出进行比对并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第二序列读出还通过以下获得：用肌苷碱基延伸细胞游离dna双链体的第二链的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端，并将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体连接。在一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：从第二序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第二链的3’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第二链的3’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端的长度或序列。

56、在上述存储介质的一些实施方案中，延伸细胞游离dna双链体的第一链的3’末端包括形成3’单一的肌苷突出端。在一些实施方案中，测序衔接子包含与3’单一的肌苷突出端互补的3’胞嘧啶突出端。

57、本文中还描述了存储一个或更多个程序的非暂态计算机可读存储介质，所述一个或更多个程序包含指令，所述指令在由系统的一个或更多个处理器执行时，使得系统：接收通过以下而获得的第一序列读出：将测序衔接子与细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端连接，用肌苷碱基延伸测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端，以及将测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第二链的5’末端连接，其中所连接的3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸；确定第一序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基；从第一序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第二链的5’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，所述指令还使得系统基于细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端的长度或序列来检测疾病（例如癌症）的存在或不存在。

58、在上述存储介质的一些实施方案中，将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接包括：延伸细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端以提供3’延伸，其中第二测序衔接子包含与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸互补的3’突出端；以及将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’延伸连接。在一些实施方案中，细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端使用相同碱基类型的核苷酸碱基进行延伸。

59、在上述存储介质的一些实施方案中，第一序列读出中的一个或更多个碱基通过这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第一序列读出与参考序列进行比对，并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。

60、在上述存储介质的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：接收通过对细胞游离dna双链体的第二链进行测序获得的第二序列读出，并确定第二序列读出中待被软剪切的一个或更多个碱基。在一些实施方案中，第二序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第二序列与参考序列进行比对，并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第一序列读出和第二序列读出通过唯一分子标识符（umi）相关联。在一些实施方案中，第一序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第一序列与第二序列读出进行比对并鉴别第一序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第二序列读出中的一个或更多个碱基根据这样的方法被确定为待进行软剪切：所述方法包括将第二序列与第一序列读出进行比对并鉴别第二序列读出的未比对上的部分。在一些实施方案中，第二序列读出还通过以下获得：将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接；用肌苷碱基延伸第二测序衔接子的3’末端以填充细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端；将第二测序衔接子的3’肌苷延伸的末端与细胞游离dna双链体的第一链的5’末端连接，其中3’肌苷延伸的末端提供了细胞游离dna双链体的第一链的5’肌苷延伸。在一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统：从第二序列读出中软剪切与细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸相对应的碱基；以及基于对细胞游离dna双链体的第一链的3’肌苷延伸的软剪切来确定细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端的长度或序列。在一些实施方案中，将第二测序衔接子与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接包括将单一肌苷与细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接，以及将第二测序衔接子与肌苷连接。在一些实施方案中，测序衔接子包含与和细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端连接的单一肌苷互补的3’胞嘧啶突出端。

61、在上述存储介质的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含umi。

62、在上述存储介质的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子是y形测序衔接子。在一些实施方案中，衔接子可以是y全长衔接子（例如，包含索引序列的y形衔接子）、短柄衔接子或发夹衔接子。

63、在上述存储介质的一些实施方案中，细胞游离dna双链体获自疑似患有癌症的对象或确定为患有癌症的对象。

64、在上述存储介质的一些实施方案中，细胞游离dna双链体获自对象。

65、在上述存储介质的一些实施方案中，细胞游离dna双链体获自液体活检样品。例如，在一些实施方案中，样品是液体活检样品，并且包括血液、血浆、脑脊液、痰、粪便、尿或唾液。

66、在上述存储介质的一些实施方案中，细胞游离dna双链体是循环肿瘤dna（ctdna）双链体。

67、在上述存储介质的一些实施方案中，测序衔接子或第二测序衔接子包含扩增引物结合位点、流动池衔接子序列或基底衔接子序列。

68、在上述存储介质的一些实施方案中，测序包括使用大规模平行测序（mps）技术、全基因组测序（wgs）、全外显子组测序、靶向测序、直接测序或桑格测序技术。在一些实施方案中，测序包括大规模平行测序，并且大规模平行测序技术包括下一代测序（ngs）。在一些实施方案中，测序使用下一代测序仪进行。

69、在上述存储介质的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统生成报告，所述报告显示以下的长度：细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端和/或细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端。在一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统将报告传输至健康护理提供者。在一些实施方案中，报告通过计算机网络或对等连接传输。

70、在上述存储介质的一些实施方案中，所述指令在由一个或更多个处理器执行时，还使得系统通过一个或更多个处理器生成对象的基因组谱，所述基因组谱包含以下的长度：细胞游离dna双链体的第一链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第二链的3’突出端、细胞游离dna双链体的第一链的5’突出端和/或细胞游离dna双链体的第二链的5’突出端。在一些实施方案中，对象的基因组谱还包含来自以下的结果：全面基因组谱分析（cgp）测试、基因表达谱分析测试、癌症热点组测试、dna甲基化测试、dna片段化测试、rna片段化测试、或其任意组合。在一些实施方案中，对象的基因组谱还包含来自基于核酸测序的测试的结果。