一种治疗α-地贫的基因修饰造血干/祖细胞的制备方法及其产品和应用

本发明涉及基因工程，主要涉及基因修饰细胞，具体涉及一种治疗α-地贫的基因修饰造血干/祖细胞的制备方法及其产品和应用。

背景技术：

1、α-地中海贫血（简称α-地贫）是一种由于α-珠蛋白基因缺失或突变导致α-珠蛋白链合成不足的常染色体隐性遗传病。重型α-地贫（如bart’s水肿胎）患者四个α-珠蛋白基因全部缺失，胎儿期即发生严重溶血性贫血、组织缺氧和全身水肿，常导致死胎或新生儿死亡。对于少数存活或晚发型重型患者，目前标准疗法是终身规律输血结合祛铁治疗，但这不仅给患者带来巨大经济负担和生活质量下降，还会导致铁过载、器官损伤等严重并发症。随着医疗技术的发展，基因治疗成为根治单基因遗传病的希望。其中，基因造血干细胞移植是根治α-地中海贫血的有效方法之一，但受限于人类白细胞抗原（hla）相合供者匮乏、移植相关死亡及移植物抗宿主病（gvhd）风险，其临床应用受到极大限制。

2、现有技术中，尽管基于crispr/cas9的基因编辑技术，特别是靶向γ-珠蛋白基因（hbg）位点以整合α-珠蛋白基因的修复策略，已在干细胞模型中证明了其治疗α-地中海贫血的可行性，但将其进一步开发为可直接应用于患者的、安全有效的自体细胞治疗产品，仍存在巨大的临床转化鸿沟，具体表现在：

3、（1）适用于原代治疗细胞的递送瓶颈：患者来源的原代造血干/祖细胞（hematopoietic stem/progenitor cells, hspcs）存在转染难度大的问题。如何将crispr编辑组件与大片段修复模板高效、安全且符合临床要求地递送至这些细胞中，是制备治疗产品的关键瓶颈。常用的转染工具（如质粒）在安全性、递送效率及临床适用性上均存在显著不足；

4、（2）治疗产品的功能完整性问题：作为“活体药物”，经编辑的造血干/祖细胞产品必须毫无争议地保留其长期自我更新和多系分化潜能，以确保回输后能实现持久的造血重建，即需要保证其作为“药物”的核心功能属性（如集落形成能力）未受损害。

5、因此，本领域迫切需要一种能够保证基因修饰造血干/祖细胞具有高效、精准基因修复功能的同时，细胞功能也未受损害的制备方法，以填补从实验室验证到临床级产品之间的转化鸿沟，为开发出具有一次性根治潜力的自体细胞治疗产品，提供关键的工艺基础与候选产品原型。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有基因修饰造血干/祖细胞的制备方法存在转染效率低、细胞功能受损的缺陷，提供了一种治疗α-地贫的基因修饰造血干/祖细胞的制备方法及其产品和应用。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了一种治疗α-地贫的基因修饰造血干/祖细胞的制备方法，包括以下步骤：

3、（1）获取α-地中海贫血患者的cd34阳性原代造血干/祖细胞（cd34-hspcs）；

4、（2）将cd34阳性原代造血干/祖细胞与基因编辑体系采用电穿孔法进行转染；

5、其中，所述基因编辑体系包括cas9核糖核蛋白复合体（rnp）和重组腺相关病毒血清型6载体（raav6）；

6、所述cas9核糖核蛋白复合体由向导rna（sgrna）与cas9蛋白组装而成；所述向导rna靶向γ-珠蛋白基因的启动子区；

7、所述重组腺相关病毒血清型6载体携带有包含左侧同源臂、α-珠蛋白基因和右侧同源臂的同源重组修复模板基因；

8、（3）将转染后的cd34阳性原代造血干/祖细胞进行培养和筛选，得到治疗α-地中海贫血的基因修饰造血干/祖细胞。

9、本发明一种治疗α-地贫的基因修饰造血干/祖细胞的制备方法，通过采用由向导rna（sgrna）和cas9蛋白组装的具有瞬时作用的核糖核蛋白复合体（rnp）以及临床安全性记录良好的重组腺相关病毒血清型6（raav6）载体作为共递送体系，协同电穿孔法对cd34阳性原代造血干/祖细胞进行转染，最大程度降低了遗传毒性与免疫原性风险，不仅实现了对cd34阳性原代造血干/祖细胞的高效转染(源于rnp+raav6共递送体系的协同作用及优选的电穿孔条件)，而且能最大程度的保留细胞长期自我更新与多系分化的潜能(瞬时作用、低毒性载体及温和工艺的综合设计)，适合用于原代治疗细胞的高效、安全、标准化、规模化生产，解决了原代治疗细胞临床转化的关键瓶颈，对α-地中海贫血的彻底治疗具有重要意义。

10、其中，步骤（1）中，优选的，所述cd34-hspcs来源于动员外周血或脐带血。

11、优选的，所述cd34-hspcs通过免疫磁珠分选法富集得到。

12、其中，步骤（2）中，优选的，所述向导rna的核苷酸序列为seq id no:1：cttgtcaaggctattggtca。

13、优选的，所述cas9核糖核蛋白复合体中，向导rna与cas9蛋白的摩尔比为（2.0-3.0）﹕1；优选为2.5﹕1。

14、优选的，所述同源重组修复模板基因中，在α-珠蛋白基因与右侧同源臂之间还包含报告基因或筛选标记基因。

15、优选的，所述cas9核糖核蛋白复合体与重组腺相关病毒血清型6载体的用量为：每1×105个造血干/祖细胞，使用50-100pmol的cas9核糖核蛋白复合体，以及感染复数（moi）为1.0×103-1.0×105的重组腺相关病毒血清型6载体。

16、优选的，所述电穿孔法转染的参数为：电压1600v、脉宽10ms、脉冲次数3次。

17、其中，步骤（3）中，优选的，采用流式细胞术进行筛选。

18、为了实现上述发明目的，进一步的，本发明还提供了一种基因修饰造血干/祖细胞，所述基因修饰造血干/祖细胞是通过上述方法制备得到的。本发明基因修饰造血干/祖细胞在基因组水平（于hbg位点定点整合）、转录水平（α-珠蛋白mrna表达恢复）和细胞功能水平（完成正常的红系终末分化）上，均实现了疾病表型的有效纠正，具备明确的疾病治疗潜力。

19、为了实现上述发明目的，更进一步的，本发明还提供了一种基因修饰造血干/祖细胞在制备治疗α-地中海贫血的药物组合物中的应用。

20、其中，优选的，所述药物组合物还包括药学上可接受的冻存剂或输注用载体。

21、本发明有益效果

22、1、本发明基因修饰造血干/祖细胞的制备方法，通过采用核糖核蛋白复合体和重组腺相关病毒血清型6载体作为共递送体系，协同电穿孔法对cd34阳性原代造血干/祖细胞进行转染，最大程度降低了遗传毒性与免疫原性风险，实现了对cd34阳性原代造血干/祖细胞的高效转染。

23、2、本发明基因修饰造血干/祖细胞的制备方法，通过采用核糖核蛋白复合体和重组腺相关病毒血清型6载体作为共递送体系，协同电穿孔法对cd34阳性原代造血干/祖细胞进行转染，最大程度的保留了细胞长期自我更新与多系分化的潜能。

24、3、本发明基因修饰造血干/祖细胞的制备方法，适合用于原代治疗细胞的高效、安全、标准化、规模化生产，解决了原代治疗细胞临床转化的关键瓶颈，对α-地中海贫血的彻底治疗具有重要意义。

25、4、本发明基因修饰造血干/祖细胞在基因组水平、转录水平和细胞功能水平上，均实现了疾病表型的有效纠正，具备明确的疾病治疗潜力。