合成四糖的多肽及含有所述多肽基因的基因修饰细胞的制作方法

本发明涉及合成寡糖的多肽及其在微生物中的表达，属于生物中的酶工程、基因工程和细胞工程。

背景技术：

1、研究者发现母乳的许多有益作用都归功于人乳寡糖(humanmilkoligosaccharides，hmos)。其中，2’-岩藻糖基乳糖(2’-fl)、乳糖-n-三糖(lacto-n-triose ii，lntii)、乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)和乳糖-n-新四糖(lacto-n-neotetraose，lnnt)是hmos中的主要成分，发挥双歧因子的作用。研究证明，以牛乳或羊乳作为主要原料的婴幼儿配方奶粉中添加hmos，并且喂养婴幼儿，可以在婴幼儿的营养、免疫等方面接近母乳哺育的效果。因此，向婴幼儿奶粉、一些人造奶、乳制品、婴儿食品以及功能保健品或特殊人群食品中添加具有生理功能的hmos，将大大提高相应人群的身体素质，提高人们的生活质量。

2、由于从自然母乳中直接提取hmos当然不是一个理想的途径，研究人员已经开发了一些hmos的化学合成方法和生物合成方法。生物合成法包括酶法合成和微生物发酵合成两种途径，且具有安全无污染、运用范围广的特点。中国专利202311675639.5、202311005666.1、201680052611.8、202180010201.8和202180010202.2等公开了基因修饰的大肠杆菌等微生物发酵合成lnt的方法。其中，β-1,3/1,4-半乳糖基转移酶是合成lnt的关键酶，为了实现高效合成lnt，有必要对其进行改进，以满足大众对lnt的需求，更快地推进hmos应用于乳制品、烘焙食品、饮料等各种食品中。

技术实现思路

1、发明目的：提供一种具有催化合成乳糖-n-四糖(lacto-n-tetraose，lnt)活性的多肽，以提高生产效率。

2、技术方案：

3、本技术的第一个方面，氨基酸序列如seq id no:1所示多肽的衍生多肽，其与seqid no:1所示多肽具有至少70％及以上相同性，并具有合成lnt的活性。seq id no:1所示多肽为一种半乳糖基转移酶多肽(galactosyltransferase)，其微生物来源为紫色色杆菌(chromobacterium violaceum，wp_048405302.1)。

4、优选的，所述衍生多肽为氨基酸序列如seq id no:1所示多肽具有如下突变中的至少一种：

5、1)seq id no:1所示的氨基酸序列中第1位的氨基酸残基由m置换为mdtim，得多肽b1。

6、2)多肽b1的第111位的氨基酸残基由f置换为l，得多肽b2。

7、3)多肽b1的第119-120位的氨基酸残基由il置换为vv，得多肽b3。

8、4)多肽b1的第247-248位的氨基酸残基由aa置换为ii，得多肽b4。

9、5)多肽b3的第150位的氨基酸残基由f置换为l得多肽b5。

10、6)多肽b4的第119-120位的氨基酸残基由il置换为vv，得多肽b6。

11、7)多肽b2的第150位的氨基酸残基由f置换为l和第176-178位的氨基酸残基由ygs置换为fsa，得多肽b7。

12、8)多肽b3的第119-120位的氨基酸残基由il置换为vv和第247-248位的氨基酸残基由aa置换为ii，得多肽b8。

13、9)seq id no:1所示的氨基酸序列中第243-244位的氨基酸残基由aa置换为ii，得多肽b9。

14、本技术的第二个方面，提供了所述多肽的表达方法，包括如下步骤：

15、(a)在适合于表达所述多肽的条件下培养宿主细胞；

16、优选的，还包括：(b)回收所述多肽的步骤。

17、优选的，所述步骤(a)，首先构建编码以上所述多肽的重组质粒，然后导入到宿主细胞中；所述宿主细胞包括自然界分离的野生株，或者物理化学诱变后的变异株，或者基因工程改造后的工程菌。

18、优选的，所述宿主细胞，包括但不限于埃希氏菌属(escherichia sp.)、芽孢杆菌(bacillus sp.)、克鲁维酵母属(kluyveromyces sp.)、毕赤酵母属(pichia sp.)、酵母属(saccharomyces sp)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces sp.)、红冬孢酵母属(rhodosporidiumsp.)和耶氏酵母属(yarrowia sp.)等.

19、进一步优选的，所述宿主细胞，包括但不限于多布克鲁维酵母(kluyveromycesdobzhanskii)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(kluyveromyces thermotolerans)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、亚罗克鲁维酵母(kluyveromycesyarrowii)、毕赤酵母(pichiapastoris)、裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)和圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)等天然菌株或基因修饰菌株.

20、优选的，所述所述宿主细胞选自大肠埃希氏菌(escherichia coli)或其基因修饰菌株。

21、进一步优选的，所述宿主细胞细则大肠杆菌基因工程菌e.coli bl21(de3)或其基因修饰菌株。

22、使用本领域已知的方法在适合于产生所述多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或者在适合的培养基中并在允许所述多肽表达和/或分离的条件下在实验室或工业发酵罐中进行小规模或大规模发酵(包括连续发酵、分批发酵、分批给料发酵或固态发酵)来培养细胞。培养是使用本领域已知的程序，在适合的营养培养基中发生，所述培养基包含碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可以通过商业渠道购买，或根据公开的组成制备。

23、所述多肽可以使用本领域已知的方法纯化和回收。例如，可以通过本领域已知的多种程序纯化多肽，所述程序包括但不限于色谱法(例如，离子交换色谱、亲和色谱、疏水作用色谱、凝胶过滤色谱法)、电泳程序法(例如，制备型等电点聚焦)、差别溶解度法(例如，硫酸铵沉淀)、sds-page法、盐析等或其组合进行分离或纯化。通过多种常规程序从营养培养基中回收变体，所述常规程序包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。

24、本技术的第三个方面，请提供了一种多核苷酸，其编码如上述第一方面所述的衍生多肽b1-b9中的任一种。

25、编码衍生多肽b1-b9的多核苷酸可以使用本领域中公知的重组dna技术来制备。这些方法包括但不限于克隆、重组、体外合成、体外扩增等方法。

26、本技术的第四个方面，提供了一种核酸构建体，其包含如上述第三方面所述的多核苷酸。

27、所述核酸构建体，优选的，还包括与所述多核苷酸可操作地连接的一个或多个调控序列，所述调控序列可指导多肽在适当的表达宿主中生产。

28、本技术的第五个方面，提供了一种酶剂，其包含第一方面所述多肽中的一种或多种。

29、本技术的第六个方面，提供了衍生多肽b1-b9在合成lnt方面的应用。

30、本技术的第七个方面，提供了一种lnt的制备方法，所述制备方法以第一方面所述多肽中的一种或多种或第五方面所述酶剂为催化剂，以半乳糖-1-磷酸和/或乳糖和/或半乳糖中的任意一种或任意组合与乙酰氨基葡萄糖和/或带有乙酰氨基葡萄糖基团的碳水化合物为底物，合成lnt。

31、优选的，所述制备方法，其中所述多肽b1-b9选自粗酶液或纯化后酶液。

32、进一步优选的，所述lnt的制备方法，反应底物为半乳糖-1-磷酸与乳糖-n-三糖(lacto-n-triose ii，lntii)。

33、本技术的第八个方面，提供了一种基因修饰细胞，所述基因修饰细胞含有第一方面所述与多肽b1-b9具有至少70％及以上相同氨基酸序列的多肽的异源核酸序列，其具有合成lnt活性的多肽。

34、优选的，所述基因修饰细胞含有第一方面所述多肽b1-b9的异源核酸序列。

35、所述基因修饰细胞，包括但不限于埃希氏菌属(escherichia sp.)、芽孢杆菌(bacillus sp.)、克鲁维酵母属(kluyveromyces sp.)、毕赤酵母属(pichia sp.)、酵母属(saccharomyces sp)、裂殖酵母属(schizosaccharomyces sp.)、红冬孢酵母属(rhodosporidium sp.)和耶氏酵母属(yarrowia sp.)等。

36、优选的，所述基因修饰细胞包括但不限于多布克鲁维酵母(kluyveromycesdobzhanskii)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、耐热克鲁维酵母(kluyveromyces thermotolerans)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)、亚罗克鲁维酵母(kluyveromycesyarrowii)、毕赤酵母(pichiapastoris)、裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)和圆红冬孢酵母(rhodosporidium toruloides)等。

37、优选的，所述基因修饰细胞选自大肠埃希氏菌(escherichia coli)。

38、本技术的第九个方面，提供了第八方面所述基因修饰细胞在合成lnt方面的应用。

39、所述应用，能够以乳糖为原料，从头合成lnt。

40、优选的，所述应用，培养基中含有乳糖、蔗糖、或甘油、或葡萄糖、或果糖，或它们的任意组合。

41、有益效果

42、本发明提供了一系列多肽及含有所述多肽基因的基因修饰细胞，其具有提高的催化合成lnt的能力。本发明提供了所述多肽的表达方法，还提供了使用所述多肽催化合成乳糖-n-四糖(lnt)的方法。本发明技术方案对于人乳寡糖的工业化生产有积极的意义，该方法绿色、高效、可持续，有利于工业化大规模生产的应用。