山苍子根粉在制备山苍子内生真菌抑菌型次级代谢通路的激活剂中的应用及培养基的制作方法

本发明属于生物，尤其涉及山苍子根粉在制备山苍子内生真菌抑菌型次级代谢通路的激活剂中的应用及培养基。

背景技术：

1、炭疽菌（

colletotrichumsp.）通过产生荚膜和外毒素侵染宿主组织、破坏细胞结构，导致植物叶片、果实等组织出现坏死斑与腐烂，是植物炭疽病的病原菌；稻黑孢霉（

nigrospora oryzae）通过菌丝体繁殖分泌毒素破坏宿主细胞，引起水稻、玉米等禾谷类作物的黑霉病；齐整小核菌（

sclerotium rolfsii）通过‌机械穿透与酶解腐蚀协同侵入‌、‌草酸等毒素诱导组织坏死‌及‌维管束物理堵塞阻断运输等方式侵染宿主，引发白绢病，广泛危害粮食与经济作物，常年给农业生产造成巨大损失，是农业生产中需要重点防控的病原微生物。然而，农药的大量使用及其产生的毒副作用，不仅致使以上常见植物病原菌出现了耐药性，还因农药残留、杀害天敌和有益微生物，严重削弱防治效果且还会破坏生态平衡。因此，亟需开发高效、低毒、环境兼容性好的新型抑菌物质。

2、山苍子[

litsea cubeba (lour.) pers.]属于木姜子属，又称山鸡椒、木姜子等，主要分布于中国和东南亚各国。山苍子的根、茎、叶和果实均可入药，富含挥发油类、生物碱类、木脂素类、黄酮类等化学成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、镇痛等药理作用，同时还可作为香精、香料等提取、制备原料，是极具开发潜力的植物资源。

3、植物内生真菌指的生命周期全部或部分存在于健康植物组织内部且不对宿主造成明显伤害的是一类真菌。植物内生真菌几乎存在于所有目前已研究过的各种陆生及水生植物中，种类繁多、分布广泛。内生真菌与植物长期协同进化，形成互利共生关系，能够帮助宿主抵抗干旱、盐碱、高温等非生物胁迫，同时可通过分泌抗菌物质或激活植物免疫系统，抵御病虫害侵袭，是生物抗菌活性产物的重要新来源，为新型抑菌剂研发提供了新思路。

4、山苍子作为重要的芳香药用植物，其内生真菌在与宿主长期共进化过程中，能够合成结构新颖、活性独特的生物活性物质，是发现新型天然抑菌剂的重要来源。但是，现有从山苍子内生真菌培养物中提取得到的次级代谢产物的抗菌活性较低，对于炭疽菌、稻黑孢霉以及齐整小核菌等植物病原菌的抑制作用不甚理想，具有较大的局限性。

技术实现思路

1、本发明发明人在新型抑菌剂的研发过程中发现，山苍子内生真菌在自然纯培养状态下，抑菌型次级代谢通路多处于沉默或低表达状态，仅维持基础生长代谢，所得次级代谢产物的抗菌活性较低；为了在培养过程中有效激活山苍子内生真菌的抑菌型次级代谢通路，提高所得次级代谢产物的抗菌活性，发明人经过深入且广泛的研究以及大量的实验，创造性地发现，在山苍子内生真菌发酵培养过程中引入山苍子根粉能够显著提高最终所得次级代谢产物的抗菌活性，在高效、低毒、环境兼容性好的新型抑菌物质的研发中具有非常优秀的应用前景。

2、推测山苍子根粉能够有效激活山苍子内生真菌抑菌型次级代谢通路的原因包括：山苍子根中富含萜类、黄酮等保守根系信号分子，可被内生真菌识别为共生胁迫信号，且山苍子根粉的引入会改变碳氮比等培养营养条件以及培养微环境，迫使内生真菌转向抑菌抗逆的次级代谢，同时山苍子根粉中所含有的活性物质会改变内生真菌染色质状态，解除通路的基因沉默，山通过同源信号模拟、微环境胁迫调控以及表观遗传调控等多重作用机制，实现对内生真菌中聚酮类化合物合成通路、萜类化合物合成通路等抑菌型次级代谢通路的有效激活，提高内生真菌的抑菌活性物质表达水平，从而显著提升所得次级代谢产物的抗菌活性。

3、更加重要的是，采用山苍子根粉作为激活剂，对提取自不同地区、不同气候、不同植株以及不同组织的山苍子内生菌，均具有一致的抗菌增强效果，是一种普适性的激活策略——首先，山苍子内生真菌长期与宿主协同进化，已演化出保守的宿主信号识别系统以及代谢调控系统，无论山苍子植株的产地、生长环境存在何种差异，内生真菌中负责识别植物根系信号、调控抑菌次级代谢的核心受体蛋白、通路调控信号基因以及信号传导通路具有较高的同源性；其次，不同山苍子内生真菌的通路基因簇结构、催化酶功能、代谢调控机制虽然存在一定差异，但内生真菌的抑菌型次级代谢通路框架具有保守性，聚酮类、萜类等抑菌代谢通路是内生真菌的核心保守代谢通路，并非单一菌株所特有，因此山苍子根粉的激活作用可适配不同来源的山苍子内生真菌，表现出对山苍子内生真菌的普适性激活；再者，山苍子根粉所具有的微环境胁迫调控作用不具有菌株特异性，不依赖于菌株的特异性遗传特征，内生真菌通过响应山苍子根粉所带来的培养环境改变，启动抑菌型次级代谢通路的代偿性激活，最终表现出激活作用的共通性。

4、此外，采用“乙酸乙酯萃取+40%~60%甲醇水溶液ods反相柱洗脱”组合的方法对山苍子内生真菌的次级代谢产物进行纯化处理，能够实现对聚酮类化合物、萜类化合物等抗菌组分的有效富集，进一步提高所得活性物质的抗菌活性。基于此，得到本发明的技术方案。

5、第一方面，本发明提供了山苍子根粉在制备山苍子内生真菌抑菌型次级代谢通路的激活剂中的应用。

6、在本发明中，所述山苍子根粉的粒径为100μm~200μm。更加具体的，所述山苍子根粉的粒径可以是100μm、110μm、125μm、150μm、160μm、180μm、200μm或它们之间的任意值。此时，所述山苍子根粉具有理想的比表面积、菌丝接触效率、保守根系信号分子释放速率，能够更好地实现对于山苍子内生真菌的抑菌型次级代谢通路的激活作用。

7、在本发明中，所述山苍子根粉的制备为现有植物原料前处理的常规技术手段，以能够将山苍子根制成特定粒径的粉末为限，本发明并不对其加以特别的限定。更加具体的，所述山苍子根粉的制备具体可以是但不限制于：取新鲜山苍子根进行洗净、烘干和粉碎，得到所述山苍子根粉。

8、第二方面，本发明提供了一种复合培养基，所述复合培养基包括质量比为1:(10~40)的山苍子根粉和大米。更加具体的，所述山苍子根粉和大米的质量比具体可以是1:10、1:15、1:20、1:30、1:40或它们之间的任意值；更优选为1:(20~30)。

9、在本发明中，所述山苍子根粉的粒径为100μm~200μm。更加具体的，所述山苍子根粉的粒径可以是100μm、110μm、125μm、150μm、160μm、180μm、200μm或它们之间的任意值。

10、在本发明中，所述复合培养基的制备包括：取所述山苍子根粉和大米混合，得到混合物；取所述混合物和水混合，进行高压灭菌处理，得到所述复合培养基。

11、在本发明中，所述复合培养基的制备中，所述混合物和水的添加比为(0.5~2)g:1ml。更加具体的，所述混合物和水的添加比具体可以是0.5g:1ml、0.8g:1ml、1g:1ml、1.3g:1ml、1.5g:1ml、2g:1ml或它们之间的任意值。

12、在本发明中，所述复合培养基的制备中，所述高压灭菌处理的温度为110℃~130℃，时间为15min~30min。更加具体的，所述高压灭菌处理的温度具体可以是110℃、112℃、115℃、118℃、120℃、125℃、130℃或它们之间的任意值；所述高压灭菌处理的时间具体可以是15min、20min、25min、30min或它们之间的任意值。

13、第三方面，本发明提供了提高山苍子内生真菌次级代谢产物抗菌活性的方法，所述方法包括：采用上述复合培养基对所述山苍子内生真菌进行发酵培养，得到发酵培养物。

14、在本发明中，所述山苍子内生真菌的制备方法包括：取山苍子植株部位进行表面消毒处理和组织切割，得到待分离组织块；取所述待分离组织块于分离培养基中进行分离培养至待分离组织块周围长出菌丝，取所述菌丝于纯化培养基中进行尖端纯化培养，得到所述山苍子内生真菌。

15、在本发明中，所述山苍子植株部位包括根、茎、叶和果实中的一种或多种。

16、在本发明中，所述山苍子内生真菌的制备中，所述表面消毒处理为现有植物原料前处理的常规技术手段，本发明并不对其加以特别的限定。更加具体的，所述表面消毒处理包括：取山苍子植株部位于70~78%乙醇中浸泡处理1min~5min，接着于5%~6%次氯酸钠溶液中浸泡处理2s~5s，完成所述表面消毒处理。

17、在本发明中，所述山苍子内生真菌的制备中，所述组织切割为现有植物原料前处理的常规技术手段，本发明并不对其加以特别的限定。更加具体的，所述待分离组织块尺寸具体包括长为1mm~4mm，宽为1mm~4mm，高为1mm~4mm。

18、在本发明中，所述山苍子内生真菌的制备中，所述分离培养基为现有植物内生真菌培养的常规技术手段，本发明并不对其加以特别的限定。更加具体的，所述分离培养基的具体实例包括但不限制于：孟加拉红培养基。

19、在本发明中，所述山苍子内生真菌的制备中，所述分离培养于黑暗条件下进行，所述分离培养的温度为25℃~30℃。更加具体的，所述分离培养的温度具体可以是25℃、26℃、27℃、28℃、30℃或它们之间的任意值。

20、在本发明中，所述山苍子内生真菌的制备中，所述纯化培养基为现有植物内生真菌培养的常规技术手段，本发明并不对其加以特别的限定。更加具体的，所述纯化培养基的具体实例包括但不限制于：pda培养基。

21、在本发明中，所述尖端纯化培养的重复次数为2次~4次。更加具体的，所述尖端纯化培养的重复次数具体可以是2次、3次或4次。此时，能够在实现对于内生真菌的有效纯化的同时，很好地保留内生真菌的抗菌活性物质合成能力、对于山苍子根粉的响应能力和生长活力。

22、在本发明中，所述方法优选的包括：取所述发酵培养物进行乙酸乙酯萃取和ods反相柱洗脱处理，得到活性物质；其中，所述ods反相柱洗脱处理采用的洗脱剂为40%~60%的甲醇水溶液。更加具体的，所述乙酸乙酯萃取和ods反相柱洗脱处理为现有天然产物分离纯化的常规技术手段，本发明并不对其加以特别的限定。

23、第四方面，本发明提供了上述复合培养基或提高山苍子内生真菌次级代谢产物抗菌活性的方法在抗菌试剂制备中的应用。

24、在本发明中，所述抗菌试剂对于炭疽菌、稻黑孢霉以及齐整小核菌等植物病原菌具有抑菌作用。更加具体的，所述抗菌试剂的具体实例包括但不限制于：抗菌药物、消毒剂、防腐剂和水质调节剂中的一种或多种。