一种可提高马铃薯自发光强度的基因组合及其应用

本技术属于植物基因工程，具体涉及一种可提高马铃薯自发光强度的基因组合及其应用。

背景技术：

1、基于真菌发光系统培育自发光植物，是植物基因工程技术领域的前沿方向。真菌发光系统途径已经被阐明：它以咖啡酸为原料，通过牛奶树碱合酶（hispidin synthase，hisps）和牛奶树碱-3-羟化酶（hispidin-3-hydroxylase，h3h）催化生成真菌荧光素；随后，荧光素在真菌荧光素酶（luciferase，luz）作用下被氧化成咖啡酰丙酮酸并发出光；最后，由咖啡酰丙酮酸水解酶（caffeoyl pyruvate hydrolase，cph）将咖啡酰丙酮酸转化成咖啡酸，从而产生持续的肉眼可见的光。

2、咖啡酸是植物合成木质素的关键中间体，它广泛存在于各种植物中且合成途径多样。因此，利用真菌发光系统培育自发光植物具有显著优势。目前，这套真菌发光系统已经在烟草等植物中表达，但其发光强度还有待提高。

3、马铃薯是世界上重要的粮食作物和经济作物，但现有马铃薯遗传转化体系主要针对2-3个基因的共转化操作，对于4个及以上基因的共转化，普遍存在转化效率低、基因表达不稳定、阳性植株得率低等技术难题。

4、因此，如何在马铃薯中实现多基因的高效共转化并使其产生稳定、高强度的自发光性状，是本领域亟待解决的技术问题之一。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本技术的目的在于提供一种可提高马铃薯自发光强度的基因组合及其应用。本技术解决了多基因在马铃薯共转化中效率低、表达不均衡的技术问题，实现5个基因在马铃薯中的稳定导入与高效表达，最终获得自发光马铃薯植株，为马铃薯新性状创制提供了基因资源和技术路径。

2、为达到此发明目的，本技术采用以下技术方案：

3、第一方面，本技术提供一种可提高马铃薯自发光强度的基因组合，所述基因组合包括

mchispss基因、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因、

nnh3hs-d37e/v181i基因、

nncphs基因和

npgas基因。

4、所述

mchispss基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

5、所述

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因的核苷酸序列包括seq id no.2所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

6、所述

nnh3hs-d37e/v181i基因的核苷酸序列包括seq id no.3所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

7、所述

nncphs基因的核苷酸序列包括seq id no.4所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

8、所述

npgas基因的核苷酸序列包括seq id no.5所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

9、在一些具体实施方式中，所述

mchispss基因、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因、

nnh3hs-d37e/v181i基因、

nncphs基因和

npgas基因分别依次由

mchisps基因（genbank no:lc435353.1）、

nnluz基因（genbank no: lc435379.1）、

nnh3h基因（genbank no:lc435367.1）、

nncph基因（genbank no: lc435389.1）和

npga基因（genbank no:af198117.1）根据马铃薯的密码子偏好性优化和/或氨基酸单点突变得到。

10、本技术优化了来自真菌的发光系统，除了重构

hisps、h3h、luz、cph这四个咖啡酸循环过程中的重要基因，还添加了4'-磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（4’-phosphopantetheinyltransferase，

npga）基因用以促进植物体内活性咖啡酸的合成。

11、同时，本技术按照马铃薯密码子偏爱性优化基因密码子，提高基因翻译效率；消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；消除基因内部和相邻基因之间逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的gc/at均衡，提高rna的稳定性；消除内含子识别序列，避免在编码区内发生内含子剪接，导致基因功能的丧失；rna的使基因编码蛋白符合n端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；避免6个或更多的连续的a+t序列，5个或更多的g+c序列；避免2、3位用cg和ta双寡核苷酸，以上序列在植物中易造成甲基化，从而引起基因沉默。

12、在基因密码子优化过程中，由于仅通过同义密码子置换无法彻底规避上述核酸序列结构缺陷，因此在不改变蛋白核心空间构象与生物学功能的前提下，对编码区非关键保守氨基酸位点进行适度微调，得到

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因和

nnh3hs-d37e/v181i基因，以破坏有害二级结构、消除回文及异常信号序列，匹配宿主密码子偏爱性的同时，保障基因在宿主中高效转录与翻译。

13、第二方面，本技术提供一种可赋予马铃薯自发光特性的基因表达盒，所述基因表达盒包括

mchispss基因表达盒、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因表达盒、

nnh3hs-d37e/v181i基因表达盒、

nncphs基因表达盒和

npgas基因表达盒。

14、所述基因表达盒均包含依次连接的camv35s启动子、目标基因和nos终止子。

15、所述目标基因分别选自第一方面所述的基因组合中的任一种基因。

16、即，所述

mchispss基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

mchispss基因（核苷酸序列包括seq id no.1所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

17、所述

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因（核苷酸序列包括seq id no.2所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

18、所述

nnh3hs-d37e/v181i基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

nnh3hs-d37e/v181i基因（核苷酸序列包括seq id no.3所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

19、所述

nncphs基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

nncphs基因（核苷酸序列包括seq id no.4所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

20、所述

npgas基因表达盒包含依次连接的camv35s启动子、

npgas基因（核苷酸序列包括seq id no.5所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列）和nos终止子。

21、在一些具体实施方式中，所述camv35s启动子来源于花椰菜花叶病毒，其核苷酸序列如seq id no.6所示。

22、在一些具体实施方式中，所述nos终止子的核苷酸序列如seq id no.7所示。

23、在一些具体实施方式中，camv35s启动子、目标基因和nos终止子的融合采用改良重叠延伸pcr技术（rihe peng et al., applied microbiology biotechnology. 2006,73:234-240）进行。

24、在一些具体实施方式中，所述用改良重叠延伸pcr技术中，pcr扩增的程序为：

25、94-96℃预变性20-40 s；

26、94-96℃变性30-60 s；56-72℃退火30-60 s；70-74℃延伸1-5 min；扩增25-35个循环；

27、70-74℃终延伸5-15 min。

28、其中，94-96℃中的具体点值可以选择94℃、94.5℃、95℃、95.5℃、96℃等，56-72℃中的具体点值可以选择56℃、60℃、64℃、68℃、72℃等，70-74℃中的具体点值可以选择70℃、71℃、72℃、73℃、74℃等，20-40 s中的具体点值可以选择20 s、25 s、30 s、35 s、40s等，30-60 s中的具体点值可以选择30 s、35 s、40 s、45 s、50 s、55 s、60 s等，1-5 min中的具体点值可以选择1 min、2 min、3 min、4 min、5 min等，5-15 min中的具体点值可以选择5 min、8 min、11 min、13 min、15 min等。

29、第三方面，本技术提供一种多基因植物转化载体，所述多基因植物转化载体包括植物表达载体和第二方面所述的基因表达盒。

30、在一些具体实施方式中，所述植物表达载体包括pcambia1301。

31、第四方面，本技术提供第一方面所述的基因组合、第二方面所述的基因表达盒或第三方面所述的多基因植物转化载体在马铃薯遗传转化中的应用。

32、第五方面，本技术提供一种马铃薯的遗传转化方法，所述遗传转化方法包括：

33、将第三方面所述的多基因植物转化载体导入农杆菌，活化后与侵染液混合得到农杆菌侵染液；

34、将马铃薯外植体与侵染液混合进行预加热处理，然后与农杆菌侵染液混合进行侵染处理和共培养，筛选抗性愈伤组织后进行分化与生根培养，得到自发光马铃薯转化苗。

35、在一些具体实施方式中，所述导入的方式包括电转化导入。

36、在一些具体实施方式中，所述农杆菌包括根癌农杆菌。

37、在一些具体实施方式中，所述侵染液包含：ms基础培养基、乙酰丁香酮、亚精胺和silwet l-77。

38、在一些具体实施方式中，以ms为基础培养基，添加乙酰丁香酮可以显著增强农杆菌对植物细胞的侵染能力，增加t-dna整合到植物基因组中的概率，能有效提升转化的成功率；亚精胺可减轻植物脱水胁迫，增强农杆菌t-dna整合；silwet l-77作为表面活性剂，能够使侵染液更均匀地渗透进外植体组织缝隙中，确保农杆菌能接触到更多的细胞。

39、本技术通过在ms基础培养基中，同时添加乙酰丁香酮、亚精胺和silwet l-77，可显著提升遗传转化的阳性转化率；且本技术创造性地发现，乙酰丁香酮和亚精胺在提升阳性转化率方面，具有显著的协同作用。

40、在一些具体实施方式中，所述侵染液包含：ms基础培养基、50-200 μm乙酰丁香酮、30-150 μm亚精胺和0.005%-0.05%wt silwet l-77。

41、在一些具体实施方式中，所述农杆菌侵染液的od600为0.3-0.5。

42、在一些具体实施方式中，所述马铃薯外植体包括马铃薯茎段。

43、在一些具体实施方式中，所述预加热处理的温度为40-50℃，预加热处理的时间为3-10 min。

44、本技术创造性地发现，通过对马铃薯外植体与侵染液混合进行预加热处理后，再与农杆菌侵染液混合进行侵染处理，可显著提升阳性转化率。

45、在一些具体实施方式中，所述侵染处理包括将预加热处理后的马铃薯外植体浸入农杆菌侵染液中，侵染10-15 min。

46、在一些具体实施方式中，所述侵染处理以震荡的方式进行。

47、在一些具体实施方式中，所述共培养包括将侵染处理后的马铃薯外植体转入共培养基，在黑暗条件下进行共培养。

48、在一些具体实施方式中，所述共培养基包含：ms基础培养基、6-苄氨基嘌呤，激动素和乙酰丁香酮。

49、在一些具体实施方式中，所述共培养基包含：ms基础培养基、1-5 mg/l 6-苄氨基嘌呤，0.1-0.5 mg/l激动素和50-200 μm乙酰丁香酮。

50、在一些具体实施方式中，所述共培养的温度为20-30℃，共培养的时间为1-3天。

51、在一些具体实施方式中，所述筛选抗性愈伤组织包括：将共培养后的马铃薯外植体转入选择培养基进行选择培养。

52、在一些具体实施方式中，所述选择培养基包含：ms基础培养基、6-苄氨基嘌呤、玉米素、赤霉素、羧苄西林和潮霉素。

53、在一些具体实施方式中，所述选择培养基包含：ms基础培养基、1-5 mg/l 6-苄氨基嘌呤，1-5 mg/l玉米素，0.1-2 mg/l赤霉素，200-800 mg/l羧苄西林和3-8 mg/l潮霉素。

54、在一些具体实施方式中，所述选择培养的方式包括：在24-26℃光暗交替条件下培养，每10-18天继代一次。

55、在一些具体实施方式中，所述分化与生根培养包含：将筛选抗性愈伤组织后，从愈伤上分化出的可发光的丛生芽转移到生根培养基，进行生根培养。

56、在一些具体实施方式中，所述生根培养基包含：ms基础培养基、萘乙酸和羧苄西林。

57、在一些具体实施方式中，所述生根培养基包含：ms基础培养基、0.05-0.2 mg/l萘乙酸和200-800 mg/l羧苄西林。

58、在一些具体实施方式中，所述生根培养的方式包含：在24-26℃光暗交替条件下培养，直至生根。

59、上述50-200 μm中的具体点值可以选择50 μm、70 μm、90 μm、110 μm、130 μm、150μm、170 μm、190 μm、200 μm等，30-150 μm中的具体点值可以选择30 μm、50 μm、70 μm、90 μm、110 μm、130 μm、150 μm等，0.005%-0.05%wt中的具体点值可以选择0.005%wt、0.01%wt、0.02%wt、0.03%wt、0.04%wt、0.05%wt等，0.3-0.5中的具体点值可以选择0.3、0.35、0.4、0.45、0.5等，40-50℃中的具体点值可以选择40℃、42℃、44℃、46℃、48℃、50℃等，3-10min中的具体点值可以选择3 min、5 min、7 min、9 min、10 min等，10-15 min中的具体点值可以选择10 min、11 min、12 min、13 min、14 min、15 min等，1-5 mg/l中的具体点值可以选择1 mg/l、2 mg/l、3 mg/l、4 mg/l、5 mg/l等，0.1-0.5 mg/l中的具体点值可以选择0.1mg/l、0.2 mg/l、0.3 mg/l、0.4 mg/l、0.5 mg/l等，20-30℃中的具体点值可以选择20℃、22℃、24℃、26℃、28℃、30℃等，1-3天中的具体点值可以选择1天、1.5天、2天、2.5天、3天等，0.1-2 mg/l中的具体点值可以选择0.1 mg/l、1 mg/l、1.5 mg/l、2 mg/l等，200-800 mg/l中的具体点值可以选择200 mg/l、400 mg/l、600 mg/l、800 mg/l等，3-8 mg/l中的具体点值可以选择3 mg/l、4 mg/l、5 mg/l、6 mg/l、7 mg/l、8 mg/l等，24-26℃中的具体点值可以选择24℃、24.5℃、25℃、25.5℃、26℃等，10-18天中的具体点值可以选择10天、18天、14天、16天、18天等，0.05-0.2 mg/l中的具体点值可以选择0.05 mg/l、0.1 mg/l、0.15 mg/l、0.2mg/l等。

60、第六方面，本技术提供一种自发光马铃薯，所述自发光马铃薯含有第一方面所述的基因组合。

61、所述基因组合包括

mchispss基因、

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因、

nnh3hs-d37e/v181i基因、

nncphs基因和

npgas基因。

62、所述

mchispss基因的核苷酸序列包括seq id no.1所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

63、所述

nnluzs-i3s/n4t/f11l/i63t基因的核苷酸序列包括seq id no.2所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

64、所述

nnh3hs-d37e/v181i基因的核苷酸序列包括seq id no.3所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

65、所述

nncphs基因的核苷酸序列包括seq id no.4所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

66、所述

npgas基因的核苷酸序列包括seq id no.5所示的序列或与其具有至少90%同源性且功能相似的序列。

67、与现有技术相比，本技术具有如下有益效果：

68、本技术提供了一种包含5个基因的基因组合，通过密码子优化和特定的氨基酸单点突变，显著提高了马铃薯的自发光强度。同时，本技术提供的适配多基因共转化的马铃薯遗传转化方法，该5基因组合在马铃薯中的转化效率得到显著提高，转化周期缩短为60天左右，并可稳定表达，获得自发光马铃薯植株，且在所有发育阶段都能用肉眼看到发光现象。该自发光马铃薯可用作阳台观赏性绿植或小夜灯，具有重要的观赏应用价值和市场前景。