一种调控丝素蛋白微球β折叠含量及均一性的方法

本发明涉及天然高分子功能材料制备，具体涉及一种调控丝素蛋白微球β折叠含量及均一性的方法。

背景技术：

1、丝素蛋白是家蚕茧壳中提取的天然结构性蛋白，凭借优异的生物相容性、低免疫原性、可降解性及可加工性，成为生物医用、柔性电子、智能高分子材料领域的核心基材。丝素蛋白的宏观性能取决于其二级结构占比，其中β折叠为结晶稳态结构，决定材料的力学强度、耐水性、热稳定性与抗降解性能；无规卷曲与α螺旋为亚稳态非晶结构，结构松散、亲水易溶、力学性能差、降解速度快。

2、目前已公开及行业通用的丝素蛋白微球制备与可控力学性能技术存在显著不足：现有工艺无法同步实现：β折叠精准可控、无化学有毒残留、粒径球形高度均一、高力学稳定性、可控降解。因此，只能牺牲某一项指标换取另一项性能，产品综合性能存在短板，主要有以下方面：

3、（1）传统微球制备工艺粒径不均一、球表面多孔粗糙，球形度差：机械乳化微球粒径跨度可达到约5～200μm，而在多领域应用中要求单分散微球，粒径跨度大的微球经多级筛分后合格产率不满足商业化利益需求，原料损耗高、生产成本上升；电喷雾、冷冻干燥微球表面多孔粗糙，球形度差。临床应用时短板凸显，如作为皮下填充材料会加剧巨噬细胞吞噬，因此缩短体内支撑周期。

4、（2）传统改善微球力学性能的方式，降低了材料的生物相容性：无交联剂的原生丝素微球虽生物相容性优异，但β折叠含量低、水溶后易溃散、力学强度弱，在人体内 1～2 周便快速降解，因此无法满足医美长效填充、药物缓释释药等多领域应用的需求；虽然通过添加交联/有机溶剂改性（乙醇、甲醇等）的方式可提升力学稳定性、延长降解周期，但残留物质极易引发炎症，使得生物安全性下降。

5、（3）构象可控性不足：现有丝素蛋白微球制备工艺难以稳定精准调控产物的β折叠含量至较高水平。喷雾干燥、机械乳化等可规模化量产的工艺虽生产效率较高，但制备过程中的高温环境与强剪切作用会破坏丝素蛋白有序二级结构，使其β折叠含量不均一；同时受限于各类添加剂量的严格管控，难以灵活调控β折叠占比，即便采用化学交联手段调节β折叠含量亦在有限狭窄范围内增加，该缺陷大幅制约了丝素蛋白材料在医用领域的拓展应用。

技术实现思路

1、本发明旨在解决现有丝素蛋白微球制备工艺所得微球β折叠含量较低且含量不均一的问题，因该问题会造成蛋白构象可控性差，微球批内、批间力学性能存在较大差异，从而导致其在体内降解速率产生差异，引发诸多临床风险。鉴于此，本发明提供了一种高效、可控、可规模化生产且能精准调控丝素蛋白微球二级结构的制备工艺，可实现微球β折叠含量精准可控，同时保持材料优异的生物相容性；克服了传统丝素蛋白微球制备工艺需额外添加交联剂或对丝素蛋白基材改性以制得性能均一微球，从而造成有毒化学物质残留、材料生物相容性下降、各项综合性能难以兼顾的行业痛点。

2、为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种调控丝素蛋白微球β折叠含量及均一性的方法，其包括以下步骤：

3、s1、采用一级同轴共聚焦单元与二级同轴共聚焦单元相串联的同轴共聚焦微流控芯片制备半成品丝素蛋白微球，其中：

4、在一级同轴共聚焦单元内，以丝素蛋白水溶液为分散相作为内部芯层流体，以含有非离子型表面活性剂的油相溶液为第一连续相作为外部环形鞘层流体，双层流体分层同轴同向供给，两者汇流时分散相被第一连续相剪切形成油包水（w/o）乳液，得到含丝素蛋白液滴的混合流体；

5、在二级同轴共聚焦单元内，以含丝素蛋白液滴的混合流体作为内部芯层流体，以含有非离子型表面活性剂的油相溶液为第二连续相作为外部环形鞘层流体，双层流体分层同轴同向供给，两者汇流后将丝素蛋白液滴压入末端流道中，以使丝素蛋白液滴在该末端流道内形成长条状或近长条状的液条；当液条流出末端流道后回弹恢复为球状，并经固化形成丝素蛋白微球的半成品；

6、相关尺寸为：分散相进料毛细管为空心圆柱体结构，其末端窄口内径为30-500 μm；过渡连接毛细管为空心圆柱体结构，内径70-700μm；末端流道为空心圆柱体结构，内径70-700μm，通道长度不小于50mm。

7、s2、将固化后的半成品丝素蛋白微球依次进行以下后处理：

8、阶段冷冻：降温至-50~-45℃，预冻90~120min，升温至-12~-8℃，保持90~150min，再次降温至-50 ~- 45℃，预冻120~180min；然后升华干燥：调节温度至-45~-30℃，真空条件下保持120~300min，再升温至0~2℃，真空条件下保持60~120min；最后解吸干燥：调节温度至15~30℃，真空条件下保持180~240min。

9、作为本发明的进一步优选技术方案，所述同轴共聚焦微流控芯片包括沿流体流向同轴依次连通的分散相进料毛细管、一级同轴聚焦腔体、过渡连接毛细管、二级同轴聚焦腔体和末端流道，由分散相进料毛细管、一级同轴聚焦腔体和过渡连接毛细管构成一级同轴共聚焦单元，由过渡连接毛细管、二级同轴聚焦腔体和末端流道构成二级同轴共聚焦单元；其中：

10、所述分散相进料毛细管同轴穿设于一级同轴聚焦腔体的入口端并延伸至一级同轴聚焦腔体内，以用于输送作为内部芯层的分散相流体；

11、所述一级同轴聚焦腔体的入口端设有第一连续相进料口，由第一连续相进料口输入的第一连续相流体于所述一级同轴聚焦腔体内与分散相流体交汇，以将分散相剪切形成丝素蛋白液滴；

12、所述过渡连接毛细管同轴衔接一级同轴聚焦腔体出口与二级同轴聚焦腔体入口，用于输送含丝素蛋白液滴的混合流体，且过渡连接毛细管同轴伸入二级同轴聚焦腔体内部；

13、所述二级同轴聚焦腔体的入口端设有第二连续相进料口，由第二连续相进料口输入的第二连续相，使得外部环形鞘层流体流速增加；

14、所述末端流道同轴连通二级同轴聚焦腔体出口，且末端流道的入口与过渡连接毛细管出口预留间隔，第二连续相经该间隔汇入含丝素蛋白液滴的混合流体实现流体加速，经加速后的丝素蛋白液滴被挤压进入末端流道，同时受末端流道约束、连续相流体挤压、剪切拉伸等作用形成长条状或近长条状的液条；液条内部丝素蛋白分子链被拉伸，原有二级结构与氢键断裂并发生分子链重排，诱导生成规整富集β折叠结构的丝素蛋白；当长条液条流出末端流道，通道约束、剪切应力消失后，长条状液条回弹恢复为球状，经固化后得到丝素蛋白微球半成品。

15、作为本发明的进一步优选技术方案，所述分散相进料毛细管延伸进一级同轴聚焦腔体内，并形成具有收敛式渐缩喉部流道，所述渐缩喉部流道的横截面积沿流体流向连续收窄，其喉部末端窄口内径小于分散相进料毛细管的进口端内孔直径，且喉部末端窄口与过渡连接毛细管同轴对接。

16、作为本发明的进一步优选技术方案，所述第一连续相进料口垂直开设于一级同轴聚焦腔体的入口端侧壁；所述第二连续相进料口垂直开设于二级同轴聚焦腔体的入口端侧壁。

17、作为本发明的进一步优选技术方案，所述固化为：在30~50℃温度条件下进行，同时，为使受热均匀，可辅助以缓慢搅拌；当固化反应完成后，过滤即可收集得到丝素蛋白微球，并通过如乙醇、离子水等洗涤多次。

18、作为本发明的进一步优选技术方案，所述分散相流体中丝素蛋白含量为0.5-10wt%；和/或，所述油相溶液中非离子型表面活性剂的浓度为0.5~20wt%。

19、作为本发明的进一步优选技术方案，所述非离子型表面活性剂选自pgpr，span80，span60，span20，pfpe-peg，brij-35、brij-78、tween 20、tween 60或tween 80中的至少一种；所述油相溶液中的油相选自大豆油、蓖麻子油、液体石蜡、矿物油、含氟油、硅油中的至少一种。本发明中，第一连续相和第二连续相独立采用上述油相与非离子型表面活性剂配制而成。

20、作为本发明的进一步优选技术方案，所述两级串联的同轴共聚焦微流控芯片制备半成品丝素蛋白微球的尺寸为50-1200 μm。

21、作为本发明的进一步优选技术方案，末端流道的内径尺寸及连续相共同作用，以使丝素蛋白液滴在末端流道受约束，形成长条状或近长条状的液条。

22、作为本发明的进一步优选技术方案，所述阶段冷冻的步骤中，降温至-50~-45℃的降温时间在50~120min内，升温至-12 ~- 8℃的升温时间在100~150min内，降温至-50~-45℃的降温时间在100~150min内；所述阶段升华干燥的真空度为50 μbar~500 mbar，所述解吸干燥的真空度为100~990 mbar；所述阶段升华干燥的步骤中，升温至-45~-30℃的升温时间在30~200min内，升温至0~2℃的升温时间在100~600min内。

23、本发明使用两级串联的同轴共聚焦微流控芯片的运行原理：分散相丝素蛋白水溶液经分散相进料毛细管流入，通过喉部渐缩段在一级同轴聚焦腔体内，在过渡连接毛细管交界口被第一连续相剪切成油包水（w/o）乳液的丝素蛋白液滴；随着流体进一步推进，进入二级同轴聚焦腔体中，通过补加第二连续相，实现增大流速，丝素蛋白液滴被加速推进末端流道中，液滴受通道尺寸挤压的同时受连续相再次剪切拉伸，呈长条型，在此过程中，在外力拉伸作用下，丝素蛋白分子链发生取向延展，原有分子内及分子间氢键被破坏，分子链构象进行重排与有序堆砌，进而形成热力学稳定的β折叠构象并得以富集；液滴流出后，随着通道约束应力的消失，由长条状恢复至球状，最终经固化获得半成品丝素蛋白微球。

24、与现有技术相比，本发明可以达到如下有益效果：

25、微球成形阶段：分散相流体经进料毛细管流出，同时在一级同轴聚焦腔体内通入同轴同向流动的第一连续相，由于两相界面存在轴向速度差，在进料毛细管的末端喉口处产生轴对称黏性剪切应力，剪切力持续拉伸作用于流出的分散相流体，同时与界面张力相互竞争；当剪切拉伸作用超过界面张力约束时，分散相液颈发生颈缩断裂，形成微液滴乳液，在该过程中，流场诱导的拉伸应力可促进丝素蛋白分子链段取向，降低无规卷曲构象比例，并诱导部分链段向β折叠构象转变。微液滴随第一连续相液体推动进入过渡连接毛细管内，在出口端因第二连续相的流入整体增加连续相流速，将微液滴挤压推进末端流道中，微液滴受管道直径限制约束及内壁流体作用产生挤压，同时又因外界高流速连续相产生的推力，使液滴在通过狭窄流道过程中发生受限拉伸与形变，液滴内部丝素蛋白分子链进一步受到延伸取向作用，从而促进β折叠结构的形成与稳定。因此，通过两级连续流场诱导作用，可实现对丝素蛋白分子构象转变过程的逐步调控，提高微球内部β折叠结构含量。同时，通过调整末端流道的内径或长度，均可达到调控液滴拉伸的情况，从而初步控制β折叠含量。随着液体脱离末端流道管口约束后，由于气液界面张力及高分子黏弹性，从而恢复球形，整个过程实现微观β折叠提升与宏观松弛成球。

26、后处理阶段：将微球进行特定程序的冻干退火工艺，选用低温冷冻方式干燥丝素蛋白微球的水分可保证其蛋白质分子性能不受到破坏，保持其完整生物活性；同时在冷冻干燥周期内引入退火工艺，将已冻结的丝素蛋白微球升温至低于共熔点的特定温度，并保持一段时间。原本被冷冻锁住的蛋白多肽链获得运动自由度，多肽链运动后，疏水链段相互靠拢，分子内、分子间重新形成大量链间氢键；部分无规卷曲及其他非晶构象区域发生链段重排，并逐渐形成更加稳定的β折叠晶体结构，进一步提高β折叠结构比例并增强其稳定性。

27、本发明通过多工序协同调控丝素蛋白分子实现无规卷曲、α螺旋向稳定反平行β折叠的高效、均匀转变，稳定制备力学可控性高的丝素蛋白微球，打破传统单一改性模式。借鉴天然蚕茧吐丝过程中流场诱导取向与结晶调控机制，利用微流控芯片宏观通道拉伸流场与微液滴内部闭合涡流场的双重剪切作用，实现丝素蛋白肽链充分解缠、伸直、有序排布，主动驱动分子内氢键断裂、分子间氢键重构，完成β折叠原位高效成核；同时结合低温退火，固化结晶结构、消除分子内应力，降低构象回复倾向，提高结构稳定性，实现微尺度构象转化与结构锁定的同步完成。全程采用纯物理改性方式，避免化学交联导致的潜在毒性和分子结构不可逆改变，绿色安全，完整保留丝素蛋白生物相容性。