增殖调节性细胞的方法

本发明涉及一种用于产生其中原代调节性t细胞(treg)已增殖的细胞群的方法、通过所述方法获得的含有调节性t细胞的细胞群、包含含有所述调节性t细胞的细胞群的药物等。

背景技术：

1、近年来，由于调节性t细胞(treg)具有免疫反应抑制功能，使用调节性t细胞治疗各种自身免疫疾病的细胞疗法(treg疗法)的研究和开发已在世界范围内取得进展。因此，调节性t细胞预期用于治疗移植物抗宿主病(gvhd)和自身免疫性疾病，以及用于治疗和预防炎性疾病和过敏性疾病。

2、调节性t细胞大致分为两种类型：天然存在的调节性t细胞(天然treg：ntreg或胸腺treg：ttreg)和诱导型调节性t细胞(诱导型treg：itreg)，并且已知ntreg天然存在于胸腺中，而itreg通过抗原刺激和细胞因子(诸如il-2和tgf-β)诱导从外周血中的初始t细胞分化。这些调节性t细胞根据细胞中表达的标志物类型而进一步细分。

3、当从活体中去除调节性t细胞时，会自发产生各种器官特异性自身免疫性疾病，而此时移植调节性t细胞可预防自身免疫性病的发作；因此，调节性t细胞被认为在维持外周免疫自身耐受性中起着重要作用。随后，调节性t细胞已被证明不仅能够抑制自身免疫，而且能够抑制大多数免疫反应，诸如外源抗原引起的炎症、移植排斥、感染免疫、过敏和肿瘤免疫。目前已经显示，转录因子foxp3也被确定为调节性t细胞的主调节因子。

4、foxp3是treg的主调节因子，并且已知foxp3在treg中组成型表达，而在常规t细胞(tconv)中没有观察到foxp3的组成型表达，tconv不具有抑制功能，也可被称为效应t细胞或炎性t细胞。已经对在维持foxp3表达的同时有效增殖原代treg的方法进行了研究，并且已经报道了具有表达维持和细胞增殖活性的化合物、细胞因子及其组合。此类化合物和细胞因子的实例包括il-2 (npl 1至7)、il-4 (npl 2、8和9)、tnfr2激动剂抗体(npl 4、5、7和10)等。

5、此类化合物、细胞因子及其组合的其它实例包括il-3 (npl 1)、tgf-β (npl 1、3、6、8和11)等。

6、尽管如上所述，已经报道了il-2、il-4和tnfr2激动剂对原代treg的影响，但没有报道表明il-2、il-4、il-33和tnfr2拮抗剂(进一步添加il-3或tgf-β)的组合是特别优选的。

7、引用列表

8、非专利文献

9、npl 1：j immunol (2011) 186: 2262-2272

10、npl 2：immunology. 2009 jul; 127(3): 338-344

11、npl 3：plos one., 11(2): e0148474. (2016)

12、npl 4：plos one., 11(5), e0156311 (2016)

13、npl 5：front. immunol. 9: 573 (2018)

14、npl 6：clin. exp. immunol., 197(1): 52-63. (2019)

15、npl 7：scientific reports 3: 3153 (2013)

16、npl 8：immunology (2009) 128: e670-e678

17、npl 9：front. immunol. 8: 1508.doi: 10.3389/fimmu.2017.01508

18、npl 10：sci. signal. 13, eaba9600 (2020)

19、npl 11：j exp med (2003) 198(12): 1875-1886

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明的目标是提供一种用于产生其中调节性t细胞已增殖的细胞群的方法，所述方法能够高效增殖已知难以增殖的原代调节性t细胞，同时保持原代调节型t细胞的抑制功能。

3、问题的解决方案

4、作为进行广泛研究以实现上述目标的结果，本发明人获得了这样的发现，即通过在il-2、il-4、il-33和tnfr2激动剂存在下培养含有原代调节性t细胞的细胞群，调节性t细胞可高效增殖，同时保持调节性t细胞的抑制功能。

5、本发明是通过基于这些发现的进一步研究完成的，并且提供了用于产生其中调节性t细胞已增殖的细胞群、含有调节性t细胞的细胞群、药物等的以下方法。

6、[1] 一种用于制造其中调节性t细胞已增殖的细胞群的方法，所述方法包括：

7、步骤(1) 在白细胞介素(il)-2、il-4、il-33和tnfr2激动剂存在下培养含有原代调节性t细胞的细胞群。

8、[2] 根据[1]所述的方法，其中，所述步骤(1)进一步在tgf-βr激动剂存在下进行。

9、[3] 根据[1]所述的方法，其中，所述步骤(1)进一步在il-3存在下进行。

10、[4] 根据[1]所述的方法，其中，所述步骤(1)进一步在il-3和tgf-βr激动剂存在下进行。

11、[5] 根据[1]至[4]中任一项所述的方法，其中，所述tnfr2激动剂是抗tnfr2激动剂抗体。

12、[6] 根据[2]、[4]或[5]所述的方法，其中，所述tgf-βr激动剂是tgf-β。

13、[7] 根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中，步骤(1)的培养中，进一步在选自由cd30激动剂、cd3激动剂和cd28激动剂组成的组的至少一种激动剂存在下进行培养。

14、[7a] 根据[1]至[6]中任一项所述的方法，其中，步骤(1)的培养中，进一步在选自由cd30激动剂、cd3激动剂和cd28激动剂组成的组的至少一种激动剂存在下进行培养，并且随后在不存在激动剂的情况下进行培养。

15、[8] 根据[1]至[7a]中任一项所述的方法，其中，所述调节性t细胞是cd25+/foxp3+细胞。

16、[9] 根据[8]所述的方法，其中，所述cd25+/foxp3+细胞为cd4+。

17、[9a] 根据[1]至[7a]中任一项所述的方法，其中，所述调节性t细胞是cd25+/cd127-细胞。

18、[9b] 根据[1]至[9a]中任一项所述的方法，其中，所述调节性t细胞是helios+细胞。

19、[10] 一种用于增殖含有调节性t细胞的细胞群的方法，所述方法包括：

20、步骤(1a) 在il-2、il-4、il-33和tnfr2激动剂存在下培养含有原代调节性t细胞的细胞群。

21、[10a] 根据[10]所述的方法，其中，所述步骤(1a)进一步在tgf-βr激动剂存在下进行。

22、[10b] 根据[10]所述的方法，其中，所述步骤(1a)进一步在il-3存在下进行。

23、[10c] 根据[10]所述的方法，其中，所述步骤(1a)进一步在il-3和tgf-βr激动剂存在下进行。

24、[10d] 根据[10]至[10c]中任一项所述的方法，其中，所述tnfr2激动剂是抗tnfr2激动剂抗体。

25、[10e] 根据[10a]、[10c]或[10d]所述的方法，其中，所述tgf-βr激动剂是tgf-β。

26、[10f] 根据[10]至[10e]中任一项所述的方法，其中，步骤(1a)的培养中，进一步在选自由cd30激动剂、cd3激动剂和cd28激动剂组成的组的至少一种激动剂存在下进行培养。

27、[10f1] 根据[10]至[10f]中任一项所述的方法，其中，步骤(1a)的培养中，进一步在选自由cd30激动剂、cd3激动剂和cd28激动剂组成的组的至少一种激动剂存在下进行培养，并且随后在不存在激动剂的情况下进行培养。

28、[10g] 根据[10]至[10f1]中任一项所述的方法，其中，所述调节性t细胞是cd25+/foxp3+细胞。

29、[10h] 根据[10g]所述的方法，其中，cd25+/foxp3+细胞为cd4+。

30、[10i] 根据[10]至[10f1]中任一项所述的方法，其中，所述调节性t细胞是cd25+/cd127-细胞。

31、[10j] 根据[10]至[10i]中任一项所述的方法，其中，所述调节性t细胞是helios+细胞。

32、[10k] 根据[1]至[10j]中任一项所述的方法，其包括：

33、步骤(2) 将外源基因(特别是表达嵌合抗原受体的基因)引入到含有原代调节性t细胞的细胞群或通过根据[1]至[10j]中任一项所述的方法获得的含有调节性t细胞的细胞群中。

34、[11] 一种含有调节性t细胞的细胞群，其通过根据[1]至[10k]中任一项所述的方法获得。

35、[12] 一种药物，所述药物包含根据[11]所述的含有调节性t细胞的细胞群。

36、[13] 根据[12]所述的药物，其用于预防和/或治疗免疫反应异常增强。

37、[14] 一种用于预防和/或治疗免疫反应异常增强的方法，所述方法包括将根据[11]所述的含有调节性t细胞的细胞群施用于有需要的受试者。

38、[15] 根据[11]所述的含有调节性t细胞的细胞群，其用于预防和/或治疗免疫反应异常增强。

39、[16] 根据[11]所述的含有调节性t细胞的细胞群在用于预防和/或治疗免疫反应异常增强的药物的制造中的用途。

40、本发明的有利效果

41、根据本发明，原代调节性t细胞可高效增殖，同时保持原代调节性t细胞的抑制功能。