一种构建稳定细胞池的三质粒单筛选标记物系统及其应用的制作方法

本发明属于生物，涉及一种构建稳定细胞池的三质粒单筛选标记物系统及其应用。

背景技术：

1、稳定细胞池（stable cell pool）是指通过外源基因导入、基因组整合及筛选富集后获得的一类能够长期、稳定表达目的基因的细胞群体。相较于瞬时转染体系，稳定细胞池能够在连续传代过程中维持目的基因的稳定表达，因此被广泛应用于重组蛋白生产、基因功能研究、药物筛选、细胞治疗及生物制药等领域。

2、对于不同类型的重组蛋白，其稳定表达仍面临不同程度的技术挑战。例如，膜蛋白以及结构复杂的大分子蛋白常因折叠效率低、翻译后修饰复杂或细胞毒性等问题而难以实现高水平稳定表达。其中，抗体类蛋白由于通常由重链和轻链两条多肽链组成，其正确表达不仅依赖于两条链的平衡转录与翻译，还与蛋白折叠、二硫键形成及分泌途径密切相关。因此，如何高效构建具有高表达水平和良好稳定性的抗体稳定细胞池，已成为抗体药物研发及产业化生产中的关键技术问题。而且抗体稳定细胞株在抗体药物研发过程中被称作“药物研发的基石”。一株高效且稳定的细胞株，不仅直接影响目标抗体的产量、产品质量与生产成本，还能显著加快药物上市进程。

3、构建抗体细胞株的方法常用的是慢病毒法和dna转座子技术。慢病毒法是利用慢病毒将目的抗体的基因整合到宿主细胞的基因组中，常规流程是目的抗体基因优化、载体构建、慢病毒包装和纯化、细胞侵染、细胞池筛选、单细胞克隆及筛选等，该方法按质粒数量可分为单质粒系统和双质粒系统，单质粒系统是利用2a肽或者ires序列将抗体轻重链连接成一条链，然后包装成一种慢病毒，双质粒系统是把抗体的轻链和重链分别包装成两种慢病毒，然后按照一定比例混合后去侵染宿主细胞。

4、转座子普遍存在于生物的基因组中，是基因组中可移动的dna序列，能通过自身编码的酶从一个基因位置移动（跳跃）到另一个位置。作为一种基因编辑的方法，当今常用的转座系统有三种，piggybac系统、sleeping beauty系统和leap-in系统。转座系统构建抗体细胞株技术通常采用双质粒系统，即一个质粒上含有转座酶的基因，另一个质粒将抗体的轻链和重链构建在一起，两端分别连接着一个可以被转座酶特异性识别的反向末端重复序列（inverted termina repeat，itr）。后者质粒线性化后与前者质粒共转到宿主细胞内。质粒线性化后再进行转染，不仅可以提高表达框内的外源基因整合到基因组的效率，还能降低质粒骨架序列的残留，同时降低质粒所带来的瞬时表达的影响，缩短筛选时间。然而，线性化的操作增加了载体制备的复杂性，也会导致dna断裂不完整、酶切效率波动及开放链dna稳定性下降等问题，从而影响转染效率和破坏后续细胞池的一致性。

5、慢病毒构建抗体稳定细胞池的方法，单质粒系统由于插入片段大，质粒构建难度系数大，耗时长，成本高，且这种随机整合的基因编辑方法遗传稳定性差，导致不同批次细胞株产物的质量均一性差，开发周期长，通常是6-8个月。常规的单质粒转座系统构建抗体稳定细胞池，质粒构造一般是启动子-轻链-启动子-重链-启动子-筛选标志物，需要连续三次克隆或者酶切酶连接，并先后三次测序，构造成本高，周期长，难度系数大。该方法构建细胞池的周期一般在2-2.5个月内，细胞株的周期为3-3.5个月。后者常用的阳性细胞筛选方式为gs筛选系统，该筛选系统需要特定的gs缺陷型cho细胞株；培养基也有特殊要求，必须是严格的无谷氨酰胺的培养基。

6、综上所述，开发高效构建稳定细胞池的方案对于抗体等蛋白生产领域具有重要意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种构建稳定细胞池的三质粒单筛选标记物系统及其应用，以期实现快速高效构建稳定细胞池。

2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、第一方面，本发明提供了一种构建稳定细胞池的三质粒单筛选标记物系统，所述三质粒单筛选标记物系统包括第一质粒、第二质粒和第三质粒；

4、所述第一质粒含有用于表达目标蛋白第一亚基的表达框，所述第一质粒的表达框含有5’ itr序列、启动子、目标蛋白第一亚基的编码序列、ires2序列、npu dnae的c端肽的编码序列、嘌呤霉素的c端肽的编码序列和3’ itr序列；

5、所述第二质粒含有用于表达目标蛋白第二亚基的表达框，所述第二质粒的表达框含有5’ itr序列、启动子、目标蛋白第二亚基的编码序列、ires2序列、嘌呤霉素的n端肽的编码序列、npu dnae的n端肽的编码序列和3’ itr序列；

6、所述第三质粒含有用于表达转座酶的表达框，所述第三质粒的表达框含有启动子和转座酶的编码序列。

7、本发明开发了一种利用npu dnae分裂式内含肽以及嘌呤霉素作为筛选标记物，用于构建稳定细胞池的三质粒单筛选标记物系统，可用于制备由多亚基组成的目标蛋白，例如抗体等。具体地，当目标蛋白为抗体时，所述第一亚基或第二亚基则可为目标抗体的轻链或重链。

8、可选地，所述第一质粒、第二质粒和第三质粒的初始质粒各自独立地包括pcdna3.1质粒、pcdna3.4质粒、pcdna4质粒、ptt5质粒、pbi-cmv1质粒、pcmv-ha质粒、pcmv6质粒或ptetone质粒中任意一种。

9、可选地，所述第一质粒、第二质粒和第三质粒中启动子各自独立的包括cmv启动子、sv40启动子、ef1alpha启动子、cag启动子、gal1启动子或chicken beta-actin 启动子中任意一种。

10、可选地，所述转座酶包括sb转座酶或pb转座酶。

11、可选地，所述npu dnae的c端肽的长度为37 aa，所述npu dnae的n端肽的长度为102aa。

12、可选地，所述嘌呤霉素从第76-85位（n末端起）中任意相邻两个氨基酸位点之间分成n端肽和c端肽；

13、可选地，所述嘌呤霉素可从第76-77位或第78-79位或第80-81位或第82-83位或第84-85位分成n端肽和c端肽。

14、本发明一具体实施方式中，所述嘌呤霉素从第84-85位点分成n端肽和c端肽，所述嘌呤霉素的n端肽的长度为84 aa，所述嘌呤霉素的c端肽的长度为115 aa。

15、可以理解，本发明中“c端肽”和“n端肽”，是将蛋白从特定位置分成n端和c端两部分。

16、可选地，所述npu dnae的n端肽的氨基酸序列包括seq id no.1所示的序列，所述npu dnae的c端肽的氨基酸序列包括seq id no.2所示的序列。

17、可选地，所述嘌呤霉素的n端肽的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列，所述嘌呤霉素的c端肽的氨基酸序列包括seq id no.4所示的序列。

18、可选地，所述5’ itr序列的核酸序列包括seq id no.5或seq id no.7所示的序列，所述3’ itr序列的核酸序列包括seq id no.6或seq id no.8所示的序列。

19、可选地，所述ires2序列的核酸序列包括seq id no.9所示的序列。

20、第二方面，本发明提供第一方面所述的构建稳定细胞池的三质粒单筛选标记物系统在构建稳定细胞池中的应用。

21、第三方面，本发明提供一种构建稳定细胞池的方法，所述方法包括：

22、将第一方面所述的构建稳定细胞池的三质粒单筛选标记物系统转染宿主细胞，且三个质粒均不需要线性化便可直接用于转染；将转染后的宿主细胞接种于含嘌呤霉素的培养基中进行筛选，得到稳定细胞池。

23、本发明基于第一方面所述的三质粒系统，建立了一种无需质粒线性化，可直接利用环状超螺旋双链结构的质粒构建稳转细胞池的方法。该方法在保证转座效率的基础上，简化了载体操作流程，减少了dna处理过程中造成的降解与机械损伤，提高了质粒制备的稳定性和重复性。此外，超螺旋构象质粒通常具有更好的细胞转染性能，有助于提升阳性细胞获得率及目标蛋白表达水平。该方法不仅缩短了稳定细胞池的构建周期，也降低了工艺操作的复杂度，为目标蛋白高效稳定表达体系的建立提供了更为便捷和可靠的技术方案。

24、可选地，所述宿主细胞包括expi293f细胞或cho-k1细胞。

25、可选地，所述转染的方法包括化学转染或电转染。

26、可选地，所述筛选的方法包括以下步骤：

27、（1）第一轮加压：转染40~50 h后，向细胞中加入5-700 μg/ml嘌呤霉素（例如可以是10、20、30、40、50、60、70、100、150、200、300、400、500、600、650、670、680或690 μg/ml等），继续培养；

28、（2）第一轮恢复：30~40 h后，将细胞离心，并用不含嘌呤霉素的新的培养基培养；

29、（3）第二轮加压：6-10天后，再次加入5-700 μg/ml嘌呤霉素进行筛选（例如可以是10、20、30、40、50、60、70、100、150、200、300、400、500、600、650、670、680或690 μg/ml等）；

30、（4）第二轮恢复：30~40 h后，将细胞离心，并用不含嘌呤霉素的新的培养基培养；

31、（5）第三轮加压：6-7天后，再次加入5-70 μg/ml嘌呤霉素进行筛选（例如可以是10、20、30、40、50、60、65、67、68或69 μg/ml等）；

32、（6）第三轮恢复：3-4天后，在含有5-70 μg/ml的嘌呤霉素的培养基中（例如可以是10、20、30、40、50、60、65、67、68或69 μg/ml等），细胞活率维持在85%以上。

33、与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

34、本发明构建了三质粒系统，将目标蛋白第一亚基和第二亚基分别构建于两个载体之上，并借助ires2序列以及npu dnae内含肽，分别与嘌呤霉素（puro）的n端片段和c端片段相连接，所使用的质粒大小不超过7.5 kb，三个质粒的构建难度系数较低，且可同时进行合成，合成周期较短，最长仅需1周时间。筛选原理为：在内含肽的辅助下，将嘌呤霉素分割为两部分，分别与第一亚基和第二亚基相连接，只有当第一亚基和第二亚基基因均整合至宿主细胞基因组时，才能形成完整且具备功能的嘌呤霉素，因此，在细胞池筛选过程中，仅需一种抗生素即可筛选出阳性细胞。本发明基于三质粒单筛选标记物系统的方法，可在4周内获得稳定细胞池，显著缩短了细胞池的开发时长。