一种保护妊娠猪以抵抗非洲猪瘟的疫苗的制作方法

非洲猪瘟病毒（asfv）是全球影响家猪群体的最重要的致病病原体之一。本发明涉及一种保护猪（特别是妊娠猪的易感群体）以抵抗asfv感染的疫苗。

背景技术：

1、如a.c. urbano等（emerging microbes&infections, 2022, vol. 11, pp 2021- 2033）的综述文章中所述的，非洲猪瘟（asf）是一种猪的高度传染性和严重出血性病毒性疾病，流行于撒哈拉以南非洲（基于p72表面抗原的c端序列分为24种基因型）和意大利的撒丁岛（p72基因型i）。asf的跨大陆传播至少发生在三个不同的时期，最严重的一次在2007年传播至格鲁吉亚，其从黑海的波季港跨越高加索地区传播到俄罗斯联邦（rf）和东欧。在接下来的十年里，该疾病在俄罗斯联邦成为一种动物流行病，并且到2018年，其已传播至西至比利时、东至中华人民共和国，并迅速席卷东南亚和大洋洲的大部分地区。在这些地区发现的所有分离株均与格鲁吉亚2007分离株相关，通常称为asfv格鲁吉亚2007或asfv-g（us 9,808,520）。自2018年以来，asf的流行病学形势已持续恶化；2022年1月，asf病毒在意大利本土再次出现。此后，中国、俄罗斯联邦、摩尔多瓦和乌克兰报告了数起疫情复发，北马其顿报告了其首次疫情，保持未受灾害的地区中的少数国家之一的泰国也报告了其首次疫情。该病毒还于2021年出现在多米尼加共和国和海地，使得西半球40多年来首次确诊asfv。这些近期发生的事件凸显了疫情持续传播的令人极度不安的模式，而在许多这些地区中，小规模和半工业化农场占据了生猪生产的大多数，这一事实加剧了这一模式。因此，疫情爆发会带来严重的社会经济后果，造成依赖于畜牧业生产的农村生计的摧毁，并且威胁整体市场稳定和食品安全，以及严重影响动物福利。

2、非洲猪瘟病毒（asfv）是一种大的双链核质dna虫媒病毒，是非洲猪瘟病毒科（the

asfarviridaefamily）的唯一成员。病毒体具有约250 nm的直径并且由被二十面体蛋白质衣壳（或核心壳）包裹的中心核仁、内部脂蛋白膜（或内被膜）、二十面体蛋白质外衣壳和当病毒穿过质膜出芽时获得的外部脂蛋白被膜（或外被膜）组成。细胞内和细胞外病毒形式均具感染性。其自然宿主范围限于钝缘蜱属（the genus

ornithodoros）的软体蜱和猪科（the family

suidae）成员，其中其主要在单核吞噬系统的细胞、驻留巨噬细胞和特定网状细胞中复制。该病毒在非洲野猪中呈地方性流行。然而，在家猪和野猪中，临床体征差异很大，并且个体结果可能从致命到亚临床症状不等。根据所涉毒株的毒力，可出现一系列分级形式，其致死率从受感染动物的100%（超急性型）到<30%（慢性型）不等。目前影响欧洲和亚洲的基因型ii毒株具有高毒力，可导致出现该疾病的急性型，尽管有证据表明，一些毒力减弱的分离株可能在波罗的海国家的野猪和中国的家猪中传播，但有报道称自然突变的基因型ii低毒力毒株和基因型i低毒力流行毒株二者在野外均被检测到。

3、对于针对asfv的保护性免疫机制仍知之甚少。本领域已知有多种疫苗方法。本领域描述的第一种方法是使用灭活疫苗进行接种。病毒灭活是一种成熟的疫苗生产方法，实现起来相对直接，而且重要的是，与活疫苗相比，其具有更高的安全性特征。灭活过程可以阻止恢复到强毒力表型并使疫苗病毒无法传播，而这正是减毒疫苗的两个主要缺点。此外，据信对于更加易感的患者群体例如非常低龄的动物和妊娠的动物而言，其安全风险较小。在后一群体中的动物经历了显著的生理变化，并因此处于应激的代谢状态。然而，灭活并不一定产生引发保护性免疫机制的疫苗。使用多种灭活的asf抗原对猪进行免疫的尝试，尽管在某些情况下能够诱导血清学免疫反应，但并未导致获得充分的保护（cadenas-fernández等，

vaccines,2021, 9, 242；doi.org/10.3390/ vaccines9030242）。

4、另一种方法是使用亚单位、dna和病毒载体疫苗。这些疫苗展现出成功的前景，并且一些候选疫苗已被证明能够诱导特异性体液和/或细胞免疫反应，而这似乎能够给予部分至全部的保护。然而，这些研究中使用的免疫方案的不同的性质（包括疫苗类型、接种策略和挑战模型）使得结果难以比较。还需要进一步的工作以确定需要触发哪些免疫机制以给予完全持久的保护，在潜在疫苗中应包含哪些抗原（或抗原组合），以及最适宜的递送方法（urbano，同上）。

5、虽然活的减毒疫苗的固有安全性低于上文提到的疫苗，却是最有前景的asf候选疫苗。这些疫苗规避了灭活疫苗、亚单位疫苗、载体疫苗和dna疫苗均呈现出的关键问题。因其能在宿主体内成功复制，可模拟自然感染从而触发体液和细胞免疫通路两者，且通常无需佐剂。此外，一些活的减毒疫苗已被证实可引发黏膜iga抗体，这对经口服途径施用的疫苗（口服免疫对于针对野猪种群的疫苗具有实操便利性）来说是一个重要特征。虽然如此，但这些疫苗亦构成风险，因为其可能重新获得致病性（即恢复毒力）导致疾病传播，并且其有可能造成接种后反应和副作用，特别地在易感动物中。三种主要策略在活的减毒asf疫苗的生成中已被采用，它们是通过细胞传代减毒、筛选自然减毒毒株和缺失毒力相关基因。为克服活的减毒疫苗所呈现的某些安全性问题（特别是残留毒力），也尝试了已针对自然减毒毒株中毒力相关基因的进一步缺失或使基因缺失病毒适应异源细胞系。根据被缺失基因的免疫原性，这些候选疫苗也可能适用于一种被称为“diva”的接种方案：区分自然受感染的动物和接种动物。

6、如urbano（同上）中所表明的，与此同时约10种有前景的活的减毒疫苗可供使用，这些疫苗开发于2015-2022年。特别地，已公开nh/p68、ourt88/3、lv17/wb/rie1、ba71δcd2v、hlj/18-7gd、asfv-g-δi177l、asfv-g-δi177l/δlvr、sy18δi226r、asfv-g-δa137r和asfv-g-δe184l可作为活asf疫苗使用。其中，目前最有前景的活的减毒候选疫苗是由美国农业部（usda）农业研究局（ars）研制的asfv-g-δi177l毒株。它可通过肌内和口鼻途径施用，诱导强效的无菌免疫力以抵抗在遍及欧洲和亚洲的近期的疫情爆发中涉及的强毒亲本asfv格鲁吉亚2007分离株的挑战，并且特别地，该疫苗株在后续田间试验中证明对强毒越南毒株ttkn/asfv/dn/2019有效。自2022年起，asfv-g-δi177l毒株通过有条件许可在越南上市。asfv-g-δi177l衍生毒株的研发也在进行中。例如，asfv-g-δi177l/δlvr在稳定的猪上皮细胞系中高效复制，并在挑战研究中保持相同的减毒水平、免疫原特性和保护效力。其他作为实验性疫苗被测试的衍生物为asfv-g-δ9gl、asfv-g-δmgf、asfv-g-δ9gl/δuk和asfv-g-δi177l/δlvr，均由美国农业部农业研究局工程化修饰。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种向妊娠猪施用安全的活的减毒asfv疫苗，妊娠猪由于其高负荷的代谢状态，特别容易受到病原微生物感染，这类感染尤其会导致活胎损失。这可以表示为本来可以活产并且能够达到两周龄以上（特别是：能够达到至少15-21日龄）的仔猪损失。这一目的尤其在于避免仔猪数量的任何损失超过50%：即，由于妊娠期间向母体动物施用asfv疫苗导致致超过50%的胎内仔猪死产，或者存活时间不超过两周。

2、附带地，本发明的目的是，该疫苗（即，疫苗中的活的减毒asfv毒株）在动物中连续传代时不会发生毒力恢复，并且该毒株也不会传播至接种动物附近的动物。

3、为达到本发明的目的，发现包含活的减毒非洲猪瘟病毒格鲁吉亚2007-δ9gl/δuk/δep153r（asfv-g-δ9gl/δuk/δep153r）毒株的疫苗向妊娠猪施用具有保护性和安全性。除此之外，已经表明，在传统的5代传代模型中，该毒株不会恢复毒力，也不会传播给哨兵动物。

4、对于发明人来说，这是一个惊喜，特别是因为通常被认为是最有希望的asf候选疫苗，即asfv-g-δi177l，存活仔猪的损失可能高达90%。尽管在某些情况下，asf疫苗可能仍然可以接受高达50%的存活后代的损失，特别是考虑到母体动物的存活对养猪场至关重要，但任何超过50%的值都被认为是商业asf病毒疫苗不可接受的。即便如此，更低的损失，如40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或任何不高于阴性对照动物（即，未施用asf疫苗的健康妊娠猪的适宜对照组）的损失，都是特别优选的。而且，最近发表的一项研究进一步支持了这一意外发现，即从asfv-g-δ9gl/δcd2v毒株中缺失ep153r基因会消除其作为疫苗的有效性（gladue等，

viruses, 2020, 12, 1185）。类似地，据描述，nh/p68毒株中ep153r基因缺失导致疫苗毒株无法保护猪以抵抗asfv攻击（gallardo等，

vaccine, 2018, vol 36，第19期，pp2694-2704；doi.org/10.1016/j.vaccine.2018.03.040）。而且，一个或多个基因缺失对毒力恢复的影响以及病毒在感染第一只动物后传播给其他动物的能力本质上是不确定的。因此，根据本发明的毒株既安全又具有保护性，同时未出现（有效）毒力恢复或向其他动物传播的情况，这种综合效果是出乎意料的。

5、除了用于疫苗中的活的减毒asfv-g-δ9gl/δuk/δep153r毒株以外，所述疫苗通过向所述妊娠猪施用包含所述活的减毒asfv-g-δ9gl/δuk/δep153r毒株的所述疫苗来保护妊娠猪以抵抗非洲猪瘟病毒感染，本发明还涉及活的减毒asfv-g-δ9gl/δuk/δep153r毒株在制备用于保护妊娠猪以抵抗非洲猪瘟病毒感染的疫苗中的用途，以及用于保护妊娠猪以抵抗非洲猪瘟病毒感染的方法，其通过向所述妊娠猪施用包含活的减毒asfv-g-δ9gl/δuk/δep153r毒株的疫苗来实现。

6、本发明涉及一种具有（至少）9gl、uk和ep153r基因功能缺失的突变体。值得注意的是，us 9,808,520中公开了一种构建格鲁吉亚2007 (asfv-g)δ9gl/δuk毒株的编码突变体，该突变体中野生型9gl蛋白的氨基酸11-68和野生型uk蛋白的氨基酸1-85缺失（分别从相应基因中缺失173个和255个核苷酸），从而使相应基因功能失活。然而，明确的缺失本身并非是使基因功能失活的必要条件，这是本领域的公知常识。9gl和uk基因可以通过缺失这些基因稍短、稍长或稍微改变的部分来实现功能失活，只要其无法再以正常水平（即以未改变的亲本株的水平）表达，特别是完全不再表达即可。ep153r基因也是如此。

7、定义

8、

猪（swine）是属于猪科（the family of suidae）的动物，特别是由人饲养的猪类（porcine）动物，例如作为肉猪（feeder pig），饲养用于种畜或饲养用于屠宰，以及野猪（wild boars）。

9、如果asfv毒株是参考分离株格鲁吉亚2007（genbank fr682468.2），则其为

asfv格

鲁吉亚2007（asfv-g）毒株（如在us 9,808,520和o’donnel等，the journal of virology，2017年1月，第91卷，第1期，pp1-18；doi 10.1128/jvi.01760-16中所述），或是此参考分离株的天然或重组变体。优选地，当与fr682468.2的全长比对时，用于本发明的asfv格鲁吉亚2007毒株的核苷酸序列同一性为至少99%，更优选至少99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7、99.8、99.9%或甚至更高。通过使用标准化基因分型程序衍生的目前可使用的分子数据已表明，在2007年格鲁吉亚疫情爆发后，在东欧和中欧仅存在此asfv变体（gallardo等，genetic variation among african swine fever genotype ii viruses, eastern andcentral europe. emerg infect dis. 2014 sep; 20(9): 1544–1547；doi: 10.3201/eid2009.140554）。

10、使用ncbi的blasttm计算机程序（http://blast.ncbi .nlm .nih .gov/blast.cgi）进行核苷酸序列比对，选择“blastn”和“比对两个或多个序列”选项，采用标准设置和默认参数，并由此将fr682468的序列选择为主体（也称为“目标”）。

11、asfv-g-δ9gl/δuk是asfv-g的一种变体，其中9gl和uk基因（病毒基因编号分别为b119l和dp96r）已通过这些基因的至少部分缺失而出现功能上失活，使得它们不再能以正常水平（即，以未改变的亲本株的水平）表达，特别是完全不再表达。众所周知，通常不会缺失整个基因，因为这也会随之带来干扰asfv基因组中两个侧翼基因转录的风险，并且从而实际上缺失了三个基因而非一个。asfv-g-δ9gl/δuk并不排除任何进一步的突变，无论是自发地还是重组地。该毒株尤其可通过us 9,808,520以及文献（尤其是urbano，同上）中获得。

12、asfv-g-δ9gl/δuk/δep153r是asfv-g-δ9gl/δuk的一种变体，其中ep153r基因的功能失活对应于上文直接描述的9gl和uk基因的功能失活。ep153r基因和其中该基因功能失活的asfv突变株是本领域公知的，尤其可参见gladue等，

viruses, 2020, 12, 1185和petrovan等，2022

j virol,第96卷第1期，以及gallardo等，

vaccine,2018; 36:2694–2704。asfv-g-δ9gl/δuk/δep153r不排除存在任何自发或重组的其他突变。

13、

疫苗是一种适合应用于动物的构成物（constitution），具有可接受的安全性，包含免疫有效量的一种或多种抗原，即能够充分刺激目标动物免疫系统以诱导免疫反应例如抗体，以以抵抗该抗原以及以抵抗相应的自然存在的抗原以及潜在以抵抗自然存在的病原体，其通常与药学上可接受的载体（即生物相容性介质，即施用后不会在受试动物中诱导显著不良反应的介质，其能够在疫苗施用后将抗原呈递至宿主动物免疫系统）组合，例如含有水和/或任何其他生物相容性溶剂的液体或例如常用于获得冻干疫苗的固体载体（基于糖类和/或蛋白质），任选地包含免疫刺激剂（佐剂），该免疫刺激剂在施用于动物后可诱导能够保护该动物以抵抗（接种后）感染的免疫应答。对任何疫苗而言，可接受的安全性的要求与关于保护的效力同等重要。

14、疫苗

单次施用指的是，为实现保护效果，该疫苗仅需在单一时间点施用一次即可，这与常规的初免-强化方案不同，后者需要通常在6周内，优选4周内（例如2周）接种第二剂才能建立保护。由于保护作用通常会随着时间的推移而逐渐下降，单次施用疫苗并不排除在6-12个月或之后重复接种，以将保护水平重新恢复至充足状态。

15、

保护动物以抵抗asfv感染是指帮助预防、改善或治愈asfv的病原性感染，或帮助预防、改善或治愈由该感染引起的病症，例如预防或减轻由asfv感染引起的一种或多种临床体征，优选预防由于asfv感染而导致的动物死亡。对于妊娠动物，动物携带的胎儿（即，处于产前发育阶段的任何未出生的动物）被认为是妊娠动物的部分。

16、

存活的仔猪是从母猪活产的并且能够达到超过两周龄，特别是达到至少15-21日龄的仔猪。